Werk je met suikermoleculen, dan loop je bijna vanzelf tegen het probleem van ‘stereoselectieve glycosyleringsreacties’ aan: hoe krijg je het ene suikermolecuul op de beoogde manier aan een ander suikermolecuul? ‘Dat glycosyleringsreactiemechanisme kan heel simpel zijn’, zegt Thomas Boltje, universitair docent chemical biology aan de Radboud Universiteit (RU). ‘Het reactieve intermediair is in sommige gevallen goed te detecteren met bijvoorbeeld NMR, en verklaart de vorming van het reactieproduct. Maar in veel gevallen zie je een reactie-intermediair dat onmogelijk direct kan leiden tot het product dat je hebt gemaakt. In deze gevallen is de structuur van het “echte” reactieve intermediair onbekend.’

Hypothese

Voor dit probleem bestaat al jaren een hypothese dat deze reacties verlopen via andere reactieve intermediairen die in evenwicht zijn met het gedetecteerde intermediair, maar bewijs daarvoor leveren is lastig. ‘De structuren die vormen zijn instabiel, waardoor ze terugvallen in stabielere vormen en maakt detectie niet gemakkelijk’, vervolgt Boltje. ‘In een echt team-effort’ hebben Boltje, Frank de Kleijne, Floor ter Braak, Paul White en collega’s nu een methode gebruikt waarmee je veel beter kunt begrijpen wat er precies gebeurt; dat geeft weer handvatten om gerichter glycosyleringen te doen.

‘We kunnen de “onzichtbare” intermediairen direct detecteren zonder ze direct te observeren’

Paul White

Bij het koppelen van twee suikermoleculen – glycosylering – installeer je vaak een goede vertrekkende groep op het eerste koolstofatoom naast het zuurstofatoom in je ring. Omdat glycosylering in een spectrum van S_N1- en S_N2-reacties valt, heb je verschillende stadia waar het molecuul doorheen gaat (voor het reageert) die allemaal met elkaar in evenwicht zijn: van een covalente binding tussen suiker en triflaat tot het compleet los van elkaar zijn, resulterend in een triflaation en een glycosylion.

Gespecialiseerd

‘We gebruikten wat meer gespecialiseerde NMR-methodes om het kinetische proces vast te leggen’, zegt junior research scientist Frank de Kleijne. ‘Dat zijn exchange spectroscopy NMR [EXSY, red.], of chemical exchange saturation transfer NMR [CEST, red.] dat al veel wordt toegepast bij eiwitten of in MRI. Daarmee konden we het chemische evenwicht tussen het duidelijk zichtbare intermediair en het hoog reactieve intermediair gebruiken als reporter.’

Paul White, facilitair manager en volgens de groep ‘NMR-goeroe’, vult aan: ‘Bij EXSY bekijk je twee verschillende en goed zichtbare populaties: je exciteert de ene populatie en kijkt hoe die overgaat naar de andere populatie. Daaruit kun je dan de kinetiek van de reactie meten en modellen maken.’ Een andere methode is chemical exchange saturation transfer (CEST) NMR, waarbij de ene groep zichtbaar is en de andere juist niet of nauwelijks, legt hij uit. Beide methodes dragen hun steentje bij aan het inzichtelijk maken van de intermediairen. ‘We kunnen de “onzichtbare” intermediairen direct detecteren zonder ze direct te observeren’, zegt White.

‘Het goed detecteerbare reactie-intermediair is niet per se het reactieve intermediair dat het product vormt’

Thomas Boltje

Concreet legden ze acht veelgebruikte glycosyldonoren (glucose- en mannose-varianten) onder de loep, waarvan de synthese bij Floor ter Braak lag. In eerder onderzoek bekeek ze die moleculen met infrarood-ionspectroscopie (IRIS) in de gasfase. ‘In de gasfase kun je extremen afbakenen, maar het nadeel is dat het gedrag van moleculen in de gasfase niet per se representatief hoeft te zijn voor moleculen in oplossing.’

‘Daarom zijn we toch weer overgestapt op NMR-metingen’, voegt Boltje toe. ‘De acht donoren zijn al veel bestudeerd. Met deze methodes konden we een dynamisch beeld maken en zo reactiesnelheden bepalen, waarmee je kunt zien hoe de reacties verlopen. De theorie bleek in de meeste gevallen te kloppen, hoewel er één uitzondering was voor een mannosyltriflaat. In het veld bestaat er veel discussie over of er neighbouring group participation plaatsvindt en wij laten zien dat dat inderdaad het geval is en dat het van invloed is op de glycosylering. Dus: het goed detecteerbare reactie-intermediair is niet per se het reactieve intermediair dat het product vormt.’

Viewing window

Verrassend in het onderzoek was dat het goed observeerbare alfa-triflaatsignaal een ander goed zichtbaar NMR signaal werd: dat van het triflaatanion’, zegt De Kleijne. ‘Dat was zó verrassend, het was eigenlijk het startschot voor ons onderzoek.’ Als het triflaat loskomt, moet er natuurlijk iets van de suikergroep achterblijven. ‘Maar wat was dat? En hoe meet je dit? Het zorgde voor veel discussie in de groep’, zegt Boltje. ‘We hebben moeten jagen en sleutelen om te onderzoeken wat er met het suikergedeelte gebeurde, maar op een zekere avond kregen we een appje van Frank: “We hebben het intermediair gevonden!”.’

Het team is tot veel bruikbare inzichten gekomen. ‘We hebben geleerd dat er een “viewing window” bestaat waarin je dit soort reactieprocessen kunt volgen’, aldus Boltje. ‘Er zijn allerlei parameters die invloed hebben op of je een zeker intermediair wel of niet kunt zien.’

Practicumlab

Het mooie aan dit onderzoek is ook de grote toepasbaarheid en toegankelijkheid. Je hoeft dit namelijk niet alleen maar met glycosyleringsreacties te doen. White: ‘Alles met een intermediair in langzaam evenwicht in je reactie zou je in theorie kunnen bekijken met deze methode. En bijna iedere universiteit heeft NMR-apparatuur, dus dit kun je overal ter wereld toepassen.’ De Kleijne, die een zeer uitgebreide tutorial voor de NMR-methodes in de supporting information heeft geschreven voegt toe: ‘De meeste van onze metingen zijn gedaan op een 300 MHz NMR uit het practicumlab. Zó toegankelijk is het.’

De volgende stap? Er ligt onder andere een plan voor een database, aldus De Kleijne. ‘We zijn nu bezig met het in kaart brengen van wat er gebeurt als je iets aan je suiker verandert. Dus op basis van fundamenteel experimentele data aangeven wat de reactiecondities moeten worden.’

‘Er zijn nog veel meer reactie-intermediairen die we zouden willen detecteren met deze methode. Uiteindelijk willen we ook de volledige opvolgreacties kunnen meten en begrijpen’, zegt Boltje. ‘Het moet minder een kunstje worden, maar meer echte wetenschap.’

De Kleijne, F.F.J. et al. (2023) JACS, DOI: 10.1021/jacs.3c08709