“De afgelopen jaren is er met deze techniek een ware stortvloed aan genetische aandoeningen ontrafeld”, vertelt Bauke Ylstra over array Comparative Genomic Hybridisation (aCGH). Ylstra is nu hoofd van de microarray-faciliteit aan het VU medisch centrum en was daarvoor zelf in de VS betrokken bij de ontwikkeling van de microarraytechniek. aCGH detecteert zogenoemde copy number variations (CNV’s), afwijkingen in het genoom die ontstaan tijdens celdelingen.

In het zeer zeldzame geval dat er bij een celdeling iets verkeerd gaat, worden er stukken DNA en soms zelfs hele chromosomen vermenigvuldigd of verwijderd. Een bekend voorbeeld is het Down-syndroom, waarbij het gehele chromosoom 21 is gedupliceerd en dus drie keer voorkomt per cel. CNV’s kunnen echter ook bestaan uit kleinere stukken DNA die tot wel dertig keer achter elkaar op een chromosoom kunnen voorkomen. Dat soort fouten verstoort de delicate balans van de genexpressie en kan behoorlijke gevolgen hebben voor de ontwikkeling van een individu.

Verstandelijke handicaps

“Vroeger dachten we dat single nucleotide polymorphisms (SNP’s), mutaties van een enkel basenpaar, het grote verschil maakten tussen de genomen van mensen. En dat zij verantwoordelijk waren voor de hoofdmoot van de genetische ziektes”, legt Edwin Cuppen, hoogleraar genoombiologie aan de Universiteit Utrecht, uit. “Sinds 2 jaar weten we dat CNV’s, dus grotere afwijkingen, vergelijkbare gevolgen hebben.” Volgens Cuppen spelen ze zelfs bij het gros van de verstandelijke handicaps een rol.

Tot voor kort zochten de wetenschappers er echter nog niet naar. “Dat er zulke grote variaties mogelijk waren, hadden we eigenlijk niet verwacht”, verklaart Cuppen. Daarbij komt dat je CNV’s tijdens het sequencen over het hoofd ziet. Je kijkt immers alleen naar de DNA-samenstelling en niet naar het aantal kopieën van een stuk DNA.

Wie overigens denkt dat gedupliceerde of verwijderde stukken DNA alleen ontstaan bij de bevruchting, zoals bij Down-patiënten, heeft het mis. Ook bij delingen op latere leeftijd kan het fout lopen. Als meerdere kopieën van genen die celdeling reguleren in het genoom terechtkomen kunnen CNV’s bijvoorbeeld kanker veroorzaken. Recente onderzoeken laten zien dat zowel bij bepaalde typen longkanker als bij hersen- en zenuwkanker, CNV’s een belangrijke rol spelen. “In hoeverre ze de oorzaak of het gevolg zijn van kanker weten we nog niet, maar je ziet ze in bijna elke kankercel”, zegt Cuppen. “Chromosomen zijn extreem instabiel in een tumor.”

Karyotyping

CNV’s spoor je op door twee genoommonsters met een verschillende fluorescente kleur te labelen en die tegelijk op een array vol met kleine stukken DNA (probes) te laten binden. Kleurratioverschillen op specifieke plekken op de array geven vervolgens aan waar de afwijkingen tussen beide genomen zich bevinden. “Sinds kort zijn de arrays voor aCGH commercieel beschikbaar. Ze zijn daardoor nu toegankelijk voor elk lab of ziekenhuis. Hierdoor kunnen we de genetische achtergronden van voorheen onbegrepen afwijkingen nu razendsnel blootleggen”, vertelt Ylstra. “Dat leidt tot een beter begrip van de aandoeningen, verbeterde prognoses en hopelijk uiteindelijk tot behandelmethoden. Ouders werden tot nu toe vaak naar huis gestuurd met de boodschap: uw kind heeft een ontwikkelingsstoornis, maar we hebben geen idee wat de oorzaak is.”

Veel aandoeningen worden veroorzaakt door kleine variaties. “Maar om te kijken waar het in het genoom fout was gegaan, waren we vroeger afhankelijk van karyotyping, het simpelweg bekijken van chromosomen onder een microscoop”, vertelt Ylstra over de beginjaren van de medische genetica. “We konden toen alleen heel grote veranderingen waarnemen, van tien megabasenparen of meer.”

De resolutie werd al iets hoger met de komst van de Comparative Genomic Hybridisation (CGH), maar de echt grote doorbraak kwam pas met het sequensen van het menselijke genoom. “Aan de ene kant van de baai bepaalden wetenschappers met behulp van gekloneerde stukken DNA, stap voor stap de basenpaarvolgorde van de mens”, weet de microarrayspecialist zich te herinneren over zijn werkzaamheden bij het Cancer Center van de universiteit van Californië in San Francisco in die periode. “Was er een fragment klaar, dan werd het naar de andere kant van de baai gestuurd, waar wij het op een glasplaatje zetten.” Zo werd in 2001 de eerste aCGH geboren. “De resolutie van dat array lag rond de 1 tot 1,5 megabaseparen, een behoorlijke vooruitgang”, vervolgt Ylstra. “Een moleculaire microscoop voor het genoom noemden we het.”

Arrayprinter

Nadat Ylstra naar Nederland terugkeerde, begon hij aan de ontwikkeling van een array met synthetisch geproduceerde DNA-strengen in plaats van de gebruikelijke gekloneerde fragmenten. “Er was enige scepsis van mijn toenmalige baas, maar uiteindelijk lukte het toch”, vertelt hij. “Arrays waren vanaf dat moment een stuk makkelijker te maken.” Zeker nadat HP een speciale printer ontwikkelde om de kunstmatige arrays uit A, C, G en T’s op te bouwen.

Wetenschappelijke databases puilen sindsdien uit met aandoeningen die met aCGH zijn opgehelderd. Zo is gebleken dat CNV’s betrokken zijn bij onder andere autisme, schizofrenie, reuma en diabetes. Ook kwamen wetenschappers erachter dat er tussen gezonde mensen behoorlijke verschillen kunnen optreden in de aantallen kopieën van bepaalde stukken DNA, veel kleinere CNV’s blijken niet of nauwelijks invloed te hebben op de waarneembare kenmerken van een persoon.

Onzichtbaar

Cuppen benadrukt dat aCGH niet in staat is om bij alle genetische aandoeningen de oorzaak te achterhalen. “Copy number neutrale afwijkingen, zoals omgedraaide stukken DNA (inversies) en stukken DNA die ergens anders in het genoom terecht zijn gekomen (translocaties) zijn niet detecteerbaar, er treedt immers geen verschil in fluorescent signaal op”, vertelt hij. Omdat ook die wijzigingen interfereren met het genexpressiepatroon van een cel, geven ze echter wel dezelfde effecten. “Andere technieken, zoals nieuwe DNA sequenstechnologieën, moeten hierbij dus soelaas bieden.”

Ook de kosten zijn een limiterende factor, voegt Kathleen De Preter, postdoc bij het Centrum voor Medische Genetica in Gent, toe. “De prijs van een aCGH-array is ontzettend gedaald de laatste jaren, een volledige arrayanalyse kost nu zo’n 250 euro. Toch kan het nog behoorlijk oplopen als je grote hoeveelheden monsters wilt screenen.” De Preter ontwikkelde daarom een mini-aCGH die alleen stukken DNA bevat die een mogelijk verhoogde kans op een neuronale kindertumor voorspellen.

Revolutie in resolutie

“De techniek is zo goed als uitontwikkeld”, vinden Ylstra en Cuppen. “De komende jaren is het oplossend vermogen het enige wat nog echt verbeterd kan worden.” Ondanks dat CNV’s van 10 tot 20 kilobaseparen nu al betrekkelijk moeiteloos zijn te detecteren, waarmee de resolutie al honderdmaal beter is dan in het begin. Een nog hogere resolutie bereik je door aCGH met andere technieken te koppelen. Nadat met aCGH de positie van een variatie tot op 10 kilo basenparen gelokaliseerd is, kunnen kwantitatieve PCR en sequensen de afwijking tot op een basenpaar nauwkeurig in kaart brengen. Cuppen en Ylstra verwachten dat vooral dat laatste een hoge vlucht gaat maken. “Over 5 à 10 jaar zal aCGH volledig vervangen zijn door sequensen”, zo verwachten ze beiden. Voorlopig is dat echter nog te duur. “De ruwe basenpaarvolgorde van een heel menselijk genoom bepalen kost nu nog zo rond de 5.000 euro. Wil je echter kwantitatief sequensen, dan moet je minstens dertig keer rond, een duur grapje”, legt Ylstra uit.

Ruis

Bio-informaticus Sacha van Hijum, senior scientist bij NIZO food research voorziet nog wel enkele uitdagingen, vooral op het gebied van data-analyse. “Bij aandoeningen waarbij kleine CNV’s betrokken zijn, en waar je dus met hoge resolutie naar moet kijken, loop je snel tegen ruis aan. Er zijn zoveel kleine variaties die niks met de aandoening te maken hebben”, zegt hij. “Je hebt meerdere patiënten nodig met een soortgelijke aandoening om op zoek te gaan naar de gemene deler: welke CNV’s zijn specifiek aanwezig in alle of een grote subgroep van de patiënten, en zouden dus de aandoening kunnen hebben veroorzaakt?”

Dat klinkt makkelijker dan het is. “Het vergt ingewikkelde analyses, de algoritmes daarvoor zijn nog lang niet uitontwikkeld”, meent Van Hijum, “dat is wat mij betreft een grote uitdaging voor de komende jaren.”

Bron: C2W Life Sciences 9, 2 mei 2009