Zoogdiercellen in bioreactoren zagen hun menu het afgelopen decennium enorm veranderen. Hun traditionele kostje van serum uit runderbloed werd vanwege BSE ingeruild voor plantaardige peptides. Nu schrappen bioprocestechnologen bij voorkeur ook die peptides van het menu. Het doel: betere procescontrole en daarmee veiligere en goedkopere medicijnen.

“Voor de humane cellijn PER.C6 werken we aan voedingsmedia zonder een enkel eiwit en ook zonder peptidemengsels uit planten. In de nieuwe voedingsmedia zit hooguit nog één zuiver polypeptide dat deze cellen erg lekker vinden”, vertelt Gerben Zijlstra van DSM Biologics, die op dit terrein samenwerkt met Percivia, de joint venture van DSM Biologics en Crucell. Verder bestaat de ingrediëntenlijst alleen uit chemisch goed gedefinieerde componenten als aminozuren, koolstofbronnen, vitamines en spoorelementen.

Dat klinkt als een karig menu voor humane cellen die ooit gewend waren in een menselijk lichaam te groeien, waar ze via het bloed allerlei eiwitten kregen aangevoerd. Lang werd dan ook gedacht dat je zoogdiercellen in een bioreactor het best kon laten groeien op een rijk medium met een flinke plons serum uit runderbloed. Dat is een soort dikke bouillon met zeker duizend verschillende componenten erin, waaronder veel bloedeiwitten zoals albumine.

GEKKE KOEIEN

Eind vorige eeuw ging serum echter in de ban voor nieuwe productieprocessen om de risico’s op de overdracht van het BSE-prion en dierlijke virussen uit te sluiten. “Dat was in de tijd dat iedereen bang was dat virussen en prionen overal vanuit het niets zouden opduiken”, blikt Leo van der Pol terug. Hij is nu afdelingshoofd procesontwikkeling van het Nederlands Vaccin Instituut (NVI) en werkte destijds bij DSM Biologics. “Maar uiteindelijk is het meegevallen hoe groot de dreiging van BSE is. In Australië en Nieuw Zeeland hebben ze nog steeds geen gekkekoeienziekte gehad. Die landen zijn nu de grote leveranciers van veilig serum.”

Dat serum is zo veilig dat het nog steeds op de menukaart staat van de zoogdiercellijnen die vandaag de dag zo’n dertig tot veertig geregistreerde biotechmedicijnen en zo’n vijf à tien vaccins produceren. Het gaat dan vaak om medicijnen die al jaren veilig gebruikt worden door patiënten. En veranderingen in het productieproces kunnen aan die veiligheid tornen, omdat deze kleine afwijkingen in medicinale eiwitten kunnen veroorzaken. Analytisch zijn die niet op te sporen, terwijl de gevolgen dramatisch kunnen zijn. De farmawaakhonden FDA en EMEA lijken daar op korte termijn dan ook geen verandering

in te eisen.

Dat kleine wijzigingen in het productieproces zulke grote gevolgen hebben, komt vooral doordat je eigen immuunsysteem zich snel tegen je kan keren bij biotechnologische equivalenten van lichaamseigen eiwitten. Dat kan wel eens gebeuren wanneer een medicijn als epo bijvoorbeeld qua suikergroepen te veel afwijkt van de lichaamseigen variant. Dan gaat het lichaam antilichamen maken, die ook gericht zijn tegen het lichaamseigen epo, dat belangrijk is voor de vorming van nieuw bloed. Een patiënt die zulke ‘verkeerde’ epo krijgt heeft niet minder, maar juist veel meer bloedtransfusies nodig om te overleven. Bij verandering in het productieproces zijn daarom altijd nieuwe klinische studies nodig die de veiligheid in patiënten aantonen.

SCHOT HAGEL

“Voor nieuwe biotechmedicijnen die nog niet op de markt zijn, zijn er nog maar weinig mensen die een plas serum in een reactor zouden willen gooien”, vermoedt Teun van de Laar van Schering-Plough. “Cellen groeien goed op serum, maar je weet niet precies door welke componenten dat komt. Eigenlijk ben je met hagel aan het schieten om iets voor elkaar te krijgen.” De FDA en EMEA hebben dan ook aangegeven in principe geen nieuwe biotechmedicijnen meer goed te keuren die met serum zijn geproduceerd.

En daar zijn de producenten van biotechmedicijnen helemaal niet rouwig om. “Met slim ontworpen voedingsmedia zonder dierlijke componenten is de productie uiteindelijk juist flink toegenomen ten opzichte van de productie met serum als kweekmedium”, stelt Zijlstra. Volgens de Groninger zijn betere media voor 20 tot 50 procent verantwoordelijk voor de flinke toename van de eiwitproductie per liter in de afgelopen jaren. Betere expressiesystemen en betere procesvoering zijn verantwoordelijk voor de resterende productietoename.

Ook de zuivering is er na wat opstartproblemen – zonder albumine bleek het geproduceerde eiwit in eerste instantie minder stabiel – makkelijker door geworden. Zonder serum is er namelijk geen scala aan bloedeiwitten in je bioreactor die het tijdens chromatografische zuivering lastig maken het gewenste eiwit, je medicijn dus, eruit te vissen.

INSULINE

De voornaamste vervangers van bloedeiwitten in het serum waren in eerste instantie in stukjes gehakte planteneiwitten, aangevuld met zogenoemde recombinante eiwitten, die zelf ook in zoogdiercellen met een vegetarisch dieet zijn geproduceerd, zoals de groeifactor insuline. De meeste biotechprocessen die nu worden ontwikkeld gebruiken ook nog steeds zulke eiwitten, is de indruk van Clare Medlow die in Noord-Europa als vertegenwoordiger van mediumleverancier SAFC Biosciences (onderdeel van Sigma-Aldrich) bij ongeveer de helft van de producenten van biotechmedicijnen over de vloer komt.

“Maar kiezen voor losse aminozuren als vervanger van peptides en eiwitten is de toekomst”, denkt Medlow. Dat betekent dus kiezen voor zo’n karig menu als DSM Biologics aan haar PER.C6-cellen wil gaan geven. Een menu dat meer op de moderne kweekmedia van gist lijkt dan op dat van zoogdiercellen.

Dat is echter makkelijker gezegd dan gedaan. Zoogdiercellen kunnen allerlei aminozuren en andere precursors niet zelf maken en zijn ook slechter in staat om alle aanwezige substraten te benutten. Toch hebben ze in de ogen van Zijlstra niet per se eiwitten of peptides nodig. Tenminste, als je op basis van kennis van de metabole netwerken van zoogdiercellen – die weliswaar nu nog ver achterloopt bij de kennis over gist – weet welke combinatie van aminozuren en organische moleculen je ze moet geven om de eiwitproductie te stimuleren en de groei en productie van toxische stoffen te remmen. “Op dat terrein leren we veel van onze gistcollega’s in Delft.”

Voor vaccinproductie zet het NVI ook stappen in die richting. “De eerste stap was het optimaliseren van kweekmedia in veel kleinschalige kweekvaatjes via trial and error”, stelt Van der Pol. “Nu versnelt kennis van genomics het ontwerp van simpele diervrije media enorm.”

BLACK-BOX

“Eiwitten in de ban doen en kiezen voor een chemisch goed gedefinieerd medium levert een simpeler, beter controleerbaar proces op met minder stappen, besparing in grondstoffen en vaak een makkelijker zuiveringsproces”, vat Medlow de voordelen samen. “En tegenover deze voordelen staat lang niet altijd als nadeel een lagere eiwitproductie”, aldus Medlow. Bij haar bedrijf werken maar liefst vijftig R&D-specialisten aan de ontwikkeling van nieuwe media die afgestemd worden op de metabolismen van veel gebruikte cellijnen in de biotechindustrie.

Van der Pol van het NVI is het met Medlow eens. “Zeker niet als je er veel werk in stopt om het voor jouw combinatie van cellijn en product optimale medium te ontwikkelen, zoals bij PER.C6 gebeurt.”

Soms nemen procesontwerpers echter ook een lagere productie op de koop toe. Ondanks die daling in de productie kan het nog steeds goedkoper zijn om voor eiwitvrij te kiezen. Niet alleen vanwege de goedkopere media. “Als je niet voor eiwitten kiest, heeft de afdeling Quality Assurance een zorg minder”, licht Van de Laar toe. Gebruik je bijvoorbeeld recombinant albumine, het belangrijkste serumeiwit, dan moet deze afdeling nagaan of dit albumine ook in een serumvrije reactor is gekweekt. En bij plantenhydrolysaten moet je nagaan of de gebruikte proteases niet van dierlijke oorsprong zijn.

Met proteases in stukjes gehakte planteneiwitten hebben nog een ander belangrijk bezwaar: de samenstelling is niet steeds hetzelfde en je krijgt ook onbekende stoffen mee. Dat maakt het moeilijker om te garanderen of je eindproduct wel steeds hetzelfde is.

VUILE WAS

Wie een optimale procescontrole wil, kiest dus niet voor deze planteneiwitten. En dat past precies in het straatje van de FDA en EMEA, waar procescontrole het nieuwe toverwoord is. “Je voelt op je klompen aan dat deze controlerende instanties niet voor niets een steeds betere procescontrole voor biotechmedicijnen eisen. De controleurs mogen de vuile was niet buiten hangen, maar waarschijnlijk zijn ze bij hun bedrijfscontroles regelmatig een hoger percentage afgekeurde batches tegengekomen dan mocht worden verwacht op basis van de vastgelegde beschrijving en de laatste grootschalige validatie van het proces”, stelt Van der Pol. “Kritische procesparameters die direct de kwaliteit van het geproduceerde eiwit kunnen beïnvloeden, moeten voldoende benoemd zijn en de verschillende processtappen moeten steeds beter wetenschappelijk zijn onderbouwd. En daarbij hoort geen kweekmedium dat eigenlijk een black-box is.” Om die reden ging dus het serum in de ban en zijn nu ook de in stukjes gehakte planteneiwitten aan de beurt om van de menukaart te verdwijnen.

Is het dan niet raar dat de meeste bestaande processen wel op serum blijven draaien? Uit nood zijn er al geregistreerde biotechmedicijnen uit zoogdiercellen overgeschakeld naar een serumvrij medium, weet Zijlstra, ook al was het oorspronkelijke proces wel met serum ontworpen. “Voor producten die al op de markt zijn gebeurt dat alleen als het proces niet robuust is en een te variabel eindproduct oplevert. Dan moet het sowieso aangepakt worden, waardoor er toch al nieuwe klinische studies nodig zijn die de veiligheid van het anders geproduceerde medicijn in patiënten aantonen”, licht Zijlstra toe. “Dan maak je een proces ook meteen serumvrij.”

ZWANGERE KOEIEN

Voor klassieke vaccins hebben allerlei bedrijven ook al aan diervrije alternatieven gewerkt, stelt Van der Pol. “Ze hebben veel octrooien op dit terrein. Toch produceert niemand de klassieke vaccins in diervrije media. Dit terwijl de productie van de meeste recente vaccins wel serumvrij is. Bij de klassieke vaccins gebeurt dit niet zolang de FDA en EMEA dat niet eisen.”

“Vanuit procesoverwegingen zouden we best willen omschakelen. En vanuit het aspect van dierenwelzijn ook”, vertelt Van der Pol. Serum wordt namelijk gewonnen uit ongeboren kalveren. Volwassen koeien hebben zoveel antilichamen in hun bloed dat dat de opzuivering van het medicinale eiwit sterk bemoeilijkt. Dus slachten leveranciers van serum zwangere koeien om bloed te winnen uit de foetussen. “Ik heb daar plaatjes van gezien die niet prettig zijn om naar te kijken.”

“Omschakelen naar een serumvrij proces zou voor klassieke vaccins qua productieproces ruw geschat 1 miljoen euro gaan kosten”, denkt Van der Pol. “Maar daarna zijn er ook nog nieuwe klinische tests nodig om de veiligheid van deze vaccins bij baby’s aan te tonen en de kosten daarvan kunnen in de honderden miljoenen euro’s gaan lopen.” En dat lijkt een te hoge prijs als je ook met serum kunt werken waarvan de veiligheid streng wordt bewaakt. “Ik ken geen voorbeelden dat mensen daadwerkelijk besmet zijn met prionen of hiv via medicijnen uit celkweek.”

Bron: C2W life sciences 18, 27 september 2008