“Het was vijftig jaar geleden ondenkbaar dat we biologische structuren in 3D konden bekijken. Nu maken we al hele eiwitnetwerken zichtbaar”, vertelt Helen Berman. Vanuit haar kantoor aan de Amerikaanse Rutgers University in New Jersey bestiert zij al tien jaar de Protein Data Bank (PDB).

Sinds zijn oprichting in 1971 vulde de databank zich langzaam met hemoglobine, myglobine, lysozym, en chymotrypsine: kleine eiwitten die makkelijk waren te isoleren uit bloed of slachtafval. Na een aantal jaren kwamen er steeds sneller grotere structuren bij, zoals virussen, en in 2000 werd de eerste ribosomale subunit geïdentificeerd. “De databank is eigenlijk meegegroeid met het veld”, vertelt Berman, die onlangs het vijftigduizendste eiwit in de databank mocht verwelkomen. Zij verwacht exponentiële toename van bijdragen, tot 150.000 structuren in 2014.

Van alle structuren in de databank is het overgrote deel (ongeveer 43.000) met röntgendiffractie opgenomen. Meer automatisering heeft dit proces – waarbij een sterke bundel röntgenstraling door een eiwitkristal gaat – flink versneld. Vooral de snellere software voor interpretatie van het diffractiepatroon heeft het veld enorm vooruit geholpen, meent prof. Remy Loris, kristallografiedeskundige aan de Vrije Universiteit Brussel. “Als je nu het kristal eenmaal hebt, dan kun je binnen een paar dagen of weken je structuur op je beeldscherm hebben. Vroeger was je daar jaren mee bezig.” Pakweg twintig jaar geleden kon je dan ook nog promoveren op de structuur van één eiwit, nu is zo’n resultaat vaak niet meer dan een hoofdstukje in het totale proefschrift.

Het verkrijgen van het eiwitkristal is voor veel eiwitten nog steeds de moeilijkste stap, al is dat door nieuwe trucjes wel makkelijker geworden. “Dankzij speciale kits kun je honderden kristallisatiecondities met verschillende pH en zoutconcentraties parallel testen en de resultaten interpoleren”, zegt Bauke Dijkstra, hoogleraar biofysische chemie aan de Rijksuniversiteit Groningen.

Toch blijft het kristalliseren een proces van trial and error, meent de Groninger. Loris valt hem bij: “Een promovendus zal 80 procent van zijn tijd besteden aan het verkrijgen van goede kristallen. Als die uitblijven, dan moet hij weer terug naar af en een betere zuiveringsmethode proberen”, vertelt de Vlaamse hoogleraar, die onderzoek doet aan eiwitcomplexen in E.coli.

 

 

 

Behangpapier

De Synchrotron, die een miljoen keer sterkere röntgenstraling uitzendt dan de ‘ouderwetse’ generators, was een van de grootste technische revoluties in de röntgendiffractiewereld. “Bij grotere complexen heb je deze sterke straling echt nodig”, vertelt Loris, die een paar keer per jaar afreist naar de Europese Synchotron in Grenoble om daar zijn eiwitten te meten. “De eenheidscel van een eiwitcomplex – zeg maar het kleinste motief in het behangpapier – wordt steeds groter. Hierdoor moeten de röntgenstralen over veel diffractiespots worden verdeeld. Dit levert een zwak signaal op als je een ouderwetse generator gebruikt.”

Inmiddels is ook het microfocussen van de röntgenbundels in opkomst, waarbij de bundellijnen worden verfijnd van 2 mm tot 10 µm. Loris: “Hiermee kun je met kleinere kristallen werken, of met eiwitten die alleen deels geordend zijn. Door de sterke focussering op de goed geordende delen krijg je dan alsnog een signaal dat sterk genoeg is. De structuur van het ß-amyloïd, betrokken bij de ziekte van Alzheimer, is onlangs met deze techniek bepaald.”

 

Organen

Waar röntgendiffractie aan de wieg stond van het structuurophelderingonderzoek, kwam NMR pas vanaf de jaren 80 om de hoek kijken. En hoewel de grootte van het eiwit nog steeds een beperkende factor is, heeft ook NMR – waarbij je de eiwitten niet hoeft te kristalliseren – een flinke vlucht genomen met inmiddels 7.300 structuren in de databank.

Terwijl kristallografie vooral een strakke ordening in het eiwit vereist, is NMR juist geschikt voor kleinere ‘rommeligere’ eiwitten, vertelt Rob Kaptein, emeritus hoogleraar chemie aan de Universiteit Utrecht. “Veel eiwitten in het fotobiologisch systeem ontwinden bijvoorbeeld als ze lichtsignalen opvangen. Ook veel transcriptiefactoren bevatten wanordelijke gebieden.”

Kaptein onderzocht zelf vanaf de jaren 80 het lac-repressor head piece, een stukje eiwit van 60 aminozuren, zo’n 5.500 Dalton zwaar. De lac-repressor bindt aan DNA en remt daardoor het melkzuurmetabolisme in bacteriën. Naast de structuur is ook de dynamica van eiwitten van groot belang. Bij de lac-repressor bepaalt bijvoorbeeld de beweeglijkheid van de aminozuurresiduen hoe het eiwit zijn bindingsplaats (de lac-operator) vindt, weet Kaptein. “Met NMR krijg je hier veel informatie over, terwijl dat met röntgendiffractie niet kan. De dataverwerking is wel tijdrovender bij NMR.”

Met de ontrafeling van het humane genoom in 2003 is het eiwitonderzoek in een stroomversnelling geraakt. “Als je de sequentie van het eiwit kent, kun je met rekenmethodes bekijken of dit eiwit mogelijk een geheel nieuwe structuur gaat opleveren”, vertelt PDB-directeur Berman. “Je kunt zo sneller zoeken naar eiwitten met een unieke vouwing.”

Het humanegenoomproject heeft het vooral makkelijker gemaakt om eiwitten in handen te krijgen, volgens Kaptein. “We kunnen nu genen voor humane eiwitten tot expressie brengen in bacteriën of eukaryoten, terwijl je vroeger heel kleine hoeveelheden moest isoleren uit bloed of organen.”

 

Maximaal

Het veld mag dan groeien, er zit nog maar een minuscuul deel van alle biomoleculen op aarde in de huidige databank, menen de onderzoekers. Loris: “Van de vijftigduizend eiwitten die nu zijn gearchiveerd, zijn er waarschijnlijk slechts vijfduizend uniek. Veel bijdragen zijn namelijk al bekende eiwitten met een ligand of een inhibitor eraan, of met een fosfor- of suikergroep. Als je vergelijkt met alleen al de half miljoen eiwitten in het humane proteoom, dan valt de inhoud van de databank toch wat tegen.”

Toch is de wetenschap dichterbij het ontrafelen van het maximaal aantal eiwitvouwingen dan dat je op basis van bovenstaande getallen zou denken, meent Kaptein. “Ik denk dat er maximaal vijf- tot tienduizend vouwingen mogelijk zijn van globulaire eiwitten, zoals enzymen. Met structural genomics moeten we binnen tien jaar hier een goed overzicht van hebben.” Toch houdt Kaptein een slag om de arm. “Membraaneiwitten kunnen misschien nog wel verrassingen in petto hebben.”

Van deze membraaneiwitten, zoals ionenkanalen, zijn nu nog maar weinig structuren aanwezig in de huidige databank. Omdat ze zich thuis voelen in de vloeibare omgeving van het membraan, laten ze zich moeilijk in een kristal vangen. Vanwege hun grootte lijkt NMR ook geen optie. Tot nu toe is er slechts één klein membraaneiwit opgehelderd met NMR, slechts tientallen membraaneiwitten zijn met röntgendiffractie opgehelderd. Verder zijn er alleen kleinere domeinen bekend.

“Iedereen zit met spanning te wachten op de structuur van G-proteïne gekoppelde receptoren, omdat die betrokken zijn bij zoveel verschillende ziektes zoals kanker, en ziektes van het zenuwstelsel”, vertelt Loris, die dan ook verwacht dat membraaneiwitten de nieuwste rage in het veld gaan worden.

Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) zou wel eens de sleutel kunnen zijn tot het oplossen van deze membraaneiwitstructuren en andere grote complexen, zoals virussen. Hierbij vries je het eiwitmolecuul in en scan je de tweedimensionale kristallen. Als je voldoende aanzichten kunt krijgen, kun je een 3D-structuur bepalen.

In de databank zitten inmiddels 173 structuren die met deze techniek zijn opgehelderd, maar dat zullen er snel meer worden, verwacht databankdirecteur Berman. “Cryo-EM staat nu op het punt waar kristallografie zo’n 25 jaar geleden was. Jurgen Doreleijers, onderzoeker bij de University of Wisconsin, VS, vult aan: “Met cryo-EM krijg je nu nog een resolutie van 5 Ångström. Best redelijk, maar de beste NMR en röntgendiffractiemethoden halen nu al 2,5 of 2 Å. Je krijgt echter wel snel een overall indruk van de structuur en dat is altijd een goed startpunt.” Tegenwoordig combineren onderzoekers cryo-EM dan ook met kristallografie van delen van het complex om een goed atomair beeld te krijgen.

 

 

 

Rekenkracht

In de NMR-wereld is residual dipolar coupling het nieuwste snufje om grotere moleculen mee in beeld te brengen, weet Kaptein. Hierbij oriënteer je een eiwit enigszins, bijvoorbeeld met behulp van een gel die je kunt uitrekken of comprimeren. “Zo krijg je informatie over de hoeken die atoomparen (bijvoorbeeld NH-groepen) maken met de oriëntatie-as van het eiwit. In combinatie met andere parameters, zoals Nucleaire Overhauser Effecten, levert deze hoek krachtige structuurinformatie op.”

Ook de rekenkracht neemt flink toe, maar Kaptein denkt dat de computer de komende vijftien jaar nog zeker niet tegen NMR en kristallografie op kan. “Met de computer kun je al aardig in de buurt van een kleine structuur komen. Maar voor grotere eiwitten en nauwkeurige structuren is de NMR en kristallografie nog zeker niet overbodig.”

 

www.wwpdb.org (Wereldwijd)

www.rcsb.org/pdb (VS)

www.ebi.ac.uk/msd (Europa)

www.pdbj.org (Japan)

 

Discutabele bijdragen

Expres of per ongeluk, soms komen er toch fouten in de databank terecht. Hoe ruim je die op? Wetenschappelijke fouten corrigeren we in goed overleg met de auteur”, zegt databankdirecteur Helen Berman.

De PDB zou wel wat verder mogen gaan in het controleren van de inzendingen, vindt onderzoeker Jurgen Doreleijers, onderzoeker aan de University of Winsconsin. “We laten het aan de auteurs over of zij hun resultaten aanpassen of niet, dat is wat te vrijblijvend. Iemand die een foute structuur aanlevert, mag best aan de wetenschappelijke schandpaal worden genageld.”

“De PDB is geen politie”, reageert Rob Kaptein, die ook adviseur van de databank is. “Ze voorzien de discutabele bijdragen van een vlaggetje. De wetenschappelijke gemeenschap moet vervolgens over de juistheid van de informatie discussiëren, niet de PDB-staf zelf. Bovendien blijkt soms pas na jaren of een structuur klopt of niet.”

Waar Kaptein wel voor pleit, is het opnemen van de ruwe NMR-data in de databank. Bij röntgendiffractie gebeurt dit al regelmatig, maar NMR-data zijn meer divers en dus lastiger te archiveren. “Voor het tegengaan van fraude en wetenschappelijke fouten zou dat heel goed zijn. Het is ook nuttig voor je eigen lab. Vaak gaan er met het vertrek van een onderzoeker toch data verloren.”

 

Bron: C2W Life Sciences 11, 31 mei 2008