‘De doorbraak kwam van het idee om barcodes te gebruiken’, vertelt Bas van Steensel, hoogleraar chromosoombiologie aan het Erasmus Universiteit Medisch Centrum en werkzaam aan het Nederlands Kanker Instituut, het onderzoeksinstituut verbonden aan het Antoni van Leeuwenhoekziekenhuis. ‘Door een willekeurig stukje sequentie te hangen aan elk te meten DNA-fragment konden we het volgen en identificeren. Doordoor konden we het hele proces opschalen en waren we in staat om alle regulatoire elementen van het menselijk genoom in één klap gedetailleerd in beeld te brengen.’

De ontwikkeling van deze zogenaamde Survey of Regulatory Elements (SuRE) door Joris van Arensbergen in het Van Steensel-lab, leidde in 2017 tot de oprichting van de start-up Gen-X. De toepassingen richtten zich eerst op gentherapie, maar als snel bleek er veel meer mogelijk met de assay. En dus kwam er vorig jaar start-up Annogen bij, dat zich onder meer bezighoudt met celtherapie, geneesmiddelenontwikkeling en agricultural biotechnology. Wat is het succesverhaal achter deze techniek?

Promotors en enhancers

Allerlei regulatoire elementen in het niet-codende deel van ons DNA regelen de activiteit van genen (zie kader ‘Geen junk DNA’). Wanneer een mutatie in zo’n regulator voor een verstoorde genexpressie zorgt, kan een ziekte ontstaan. Maar deze mutaties identificeren en lokaliseren is ontzettend lastig. Met de huidige techniek van genome-wide association studies (GWAS) kom je er maar ten dele, vertelt Van Steensel. ‘Dit soort onderzoek geeft slechte resolutie. We kunnen wel ruwweg zeggen in welk deel van het genoom de mutatie ligt, maar niet precies waarl. En dat is wel nodig wil je de ziekte kunnen begrijpen en uiteindelijk beter kunnen behandelen.’

De SuRE-techniek bekijkt het probleem juist van de andere kant. ‘We hakken eerst het genoom op in miljoenen stukjes van zo’n vijfhonderd basenparen elk’, legt Joris van Arensbergen, ceo en oprichter van Gen-X en Annogen, uit. ‘Vervolgens bouwen we daarvan een plasmide-bibliotheek. In een standaard plasmide zit een gen, maar ook een promotor om het gen tot transcriptie te brengen. In onze assay is die promotor vervangen door zo’n onbekend stukje genoom. Daarnaast voegen we nog een barcode toe: een bekende sequentie die we associëren met dat DNA-element.’

Vervolgens worden de plasmiden getransfecteerd in een cellijn. ‘Genoom-stukjes die regulatoire elementen als promotors en enhancers bevatten, zullen de barcode dan tot expressie brengen’, vertelt Van Arensbergen. ‘Door middel van high-throughput sequencing tellen we vervolgens elke barcode in het RNA, en op die manier kunnen we de promoter en enhancer-activiteit uitlezen voor het hele genoom waarvan de bibliotheek gemaakt is. En door vervolgens verschillende genomen te vergelijken, ga je zien welke mutaties van invloed zijn op regulator-activiteit.’

Genetisch paspoort

Toepassingen zijn er legio. Juist in niet-coderend DNA zijn vaak aanwijzingen te vinden over de oorzaak van ziektes en stoornissen. Eén zo’n stoornis is autisme. ‘Autisme is grotendeels erfelijk bepaald’, vertelt universitair hoofddocent Raymond Poot (Erasmus MC). ‘Maar van meer dan 80% van de mensen met de diagnose weten we nog altijd niet waar precies op het genoom het probleem ligt.’ Het gaat hier vaak om mutaties van één basenpaar, zogenoemde single nucleotide polymorphisms (SNPs) in stukken genoom van tienduizenden tot meer dan één miljoen basenparen lang, zogenoemde loci. ‘Voor ons is het een raadsel welke SNPs in die loci ertoe doen.’

De enige techniek die wél de belangrijke SNPs in zulke grote stukken genoom kan bepalen is volgens Poot de SuRE-technologie. En dus start Poot binnenkort samen met Van Steensel en Hieab Adams, klinisch geneticus en onderzoeker aan het Erasmus MC, aan een project om met deze assay de genregulatie die in verband wordt gebracht met een verhoogde kans op autisme in kaart te brengen. ‘We willen die verborgen mutaties in regulatoire elementen vinden’, legt Poot uit. ‘Dit doen we door een SuRE-bibliotheek in humane neurale stamcellen te brengen en te zien waar transcriptie plaatsvindt. Deze neurale stamcellen leggen het brein vroeg in de zwangerschap aan. Daarmee hopen we het autistische brein beter te begrijpen.’

‘Met gebruik van SuRE in neurale stamcellen hopen we het autistische brein beter te begrijpen’

Raymond Poot

De ultieme droom is uiteindelijk om zo’n hoge resolutie te krijgen dat een ‘genetisch paspoort’ van autisme kan worden gemaakt. ‘Aan de hand daarvan kunnen we dan vaststellen of iemand een sterk verhoogde kans heeft op deze stoornis’, zegt Poot. ‘Dit zou zelfs al kort na de geboorte kunnen, bijvoorbeeld in de hielprik-screening. Hoe vroeger je een verhoogde kans op autisme vaststelt, hoe eerder hij of zij kan profiteren van gedragstherapie.’

Van Steensel denkt aan een heel andere toepassing van SuRE: kankeronderzoek. ‘Bijna alle huidige publicaties binnen dit vakgebied gaan over coderende mutaties. Maar er zitten ook ontzettend veel mutaties in het niet-coderende gedeelte van het genoom. Deze black box willen we gaan aanboren met SuRE.’

Drug screenings

Genregulatie kun je onderzoeken, maar ook gebruiken als gereedschap. Dan hebben we het bijvoorbeeld over celtherapie. ‘We doen screenings voor bijvoorbeeld biotechnologische bedrijven die graag hun proces beter willen sturen’, zegt Van Arensbergen. ‘Dat levert dan regulatoire elementen op die de expressie van bepaalde genen kunnen regelen of boosten.’ Een vergelijkbaar idee geldt voor gentherapie, dat via start-up Gen-X verloopt. Van Arensbergen: ‘Je kunt dan voor hogere efficiëntie maar ook veiligheid zoeken naar promotors of enhancers die het therapeutische gen hoog tot expressie brengen, of juist onder bepaalde omstandigheden. Bij ziektes waar ontstekingen een rol spelen, zoek je bijvoorbeeld naar een ontsteking-induceerbare promotor.’

Een groot voordeel van SuRE is dat je op basis van alleen DNA een regulatoir profiel kan genereren in ieder transfecteerbaar celtype. Aangezien je tegenwoordig ook heel makkelijk synthetisch DNA kunt bestellen, heb je feitelijk alleen de DNA-sequentie nodig om vervolgens een SuRE-bibliotheek en een regulatoir profiel te genereren. ‘Zo zijn we nu aan het kijken naar mogelijke toepassingen op moeilijk te verkrijgen DNA, zoals van de mammoet of de neanderthaler’, vertelt Joris van Arensbergen, ceo van Annogen. ‘Zulke bibliotheken moet je dan uiteraard vervolgens in vergelijkbare soorten, zoals de olifant en mens transfecteren. Hier zien we niet een hele grote markt voor, maar het lijkt ons leuk om aan dit soort projecten mee te werken.’

Ook bij geneesmiddelontwikkeling kan SuRE een rol spelen. Nu zijn zogenaamde drug screenings voor toxiciteit soms te beperkt. ‘Er word bijvoorbeeld maar gekeken naar één gen van één signaaltransductieweg’, legt Van Arensbergen uit. ‘Daardoor kun je off-target-effecten missen. Met behulp van de SuRE-assay kunnen we meerdere regulatoire DNA-elementen vinden die als gevoelige sensoren dienen om zo meerdere pathways in de gaten te houden.’

Een andere toepassing waarbinnen Annogen zijn klanten werft, is die van de productie van recombinante eiwitten, bijvoorbeeld als geneesmiddel. ‘We kunnen met name goed helpen bij heel specifieke cellijnen, zoals algen. Met SuRE kunnen we dan helpen de productie te verhogen door de juiste combinatie van promotor en enhancer te helpen kiezen voor de expressie van het recombinante gen.’

Gene editing

Hoe mooi de techniek ook is, hij zal volgens Van Arensbergen nog verder moeten worden doorontwikkeld. ‘We willen het verder opschalen om dit toepasbaar te maken voor tientallen of honderden genomen. Daarnaast moeten we bijvoorbeeld in sommige systemen achtergrondexpressie nog verder verminderen. Dit speelde bijvoorbeeld aanvankelijk in planten. Ook maken we de techniek beschikbaar voor gebruik voor in vivo screens. Hiervoor zijn we continu bezig aanpassingen en varianten op de SuRE-vector te maken.’

En wellicht ligt er nog een toepassing in het verschiet: gene editing. Met de komst van deze technologieën kun je in plaats van een compleet therapeutisch gen toe te voegen (zoals bij gentherapie), specifiek kleine veranderingen aanbrengen in het genoom. ‘Je kunt daarbij denken aan het repareren van een mutatie in een gen’, vertelt Van Arenbergen. ‘Maar in deze tijd van personalized medicine wordt ook steeds vaker gekeken naar gene editing van het niet-coderende deel van het genoom en we hopen hier een belangrijke bijdrage te kunnen leveren door duizenden potentiële edits te testen met SuRE. Zo hoef je alleen de beste in een modelsysteem te testen.’