‘Eigenlijk hebben superkritische vloeistofchromatografie (SFC, red.) en gewone vloeistofchromatografie (LC, red.) veel overeenkomsten, maar het grote verschil is de samenstelling van de mobiele fase’, vertelt Lucie Nováková, hoogleraar aan de farmaciefaculteit in Hradec Králové, Charles University in Tsjechië. SFC bestaat al sinds de jaren zestig, maar heeft in de laatste jaren een hernieuwde interesse verworven.

De mobiele fase bestaat in SFC uit superkritisch koolstofdioxide. Wanneer je op CO₂ een hoge druk en de juiste temperatuur toepast, verdwijnt de scheiding tussen de vloeistoffase en de gasfase. ‘Maar elutie met superkritisch CO₂ is vrij gelimiteerd’, vervolgt Nováková. ‘Daarom voeg je er een hoeveelheid van een organische component aan toe, meestal methanol of ethanol als het om cosmetica gaat. Het gevolg is dan wel dat je niet superkritisch maar subkritisch werkt, maar je behoudt de gunstige eigenschappen.’

‘Favoriet kernwoord’

Het is een zeer interessante techniek voor preparatieve scheidingen, vindt ook Ken Broeckhoven, hoogleraar chemische ingenieurstechnieken aan de Vrije Universiteit Brussel. ‘Je hebt veel minder oplosmiddelen nodig en je kunt stoffen scheiden die watergevoelig zijn’, zegt hij. ‘En na de scheiding kun je de CO₂ gewoon laten verdampen, waardoor je een geconcentreerd staal in methanol hebt zitten. De meeste van deze preparatieve systemen laten ook toe je CO₂ te recycleren.’ Verder is superkritisch CO₂ weinig viskeus en zorgt de hoge dichtheid dat er veel stoffen in oplossen. ‘Je hebt een beetje de voordelen van zowel gas- als vloeistofchromatografie.’

Nováková vindt de complementariteit van LC en SFC stiekem het meest interessant. ‘Bij het vergelijken van LC en SFC is complementariteit mijn favoriete kernwoord’, verklaart ze. ‘De scheidingsmechanismes zijn bij beide technieken anders en zo kun je moeilijke scheidingen van de een oplossen met de ander.’ De informatie die op deze manier beschikbaar komt, kun je vervolgens gebruiken voor onder andere omics-onderzoek en screeninganalyses, bijvoorbeeld voor doping. Broeckhoven vult aan: ‘Scheidingen met SFC zijn orthogonaal met LC; er zit niet direct een verband in de scheiding tussen beide technieken, dus veel van wat je normaal niet met LC gescheiden krijgt, lukt wel met SFC.’

Waarom is een techniek met zoveel voordelen dan toch nog niet helemaal in de mainstream wetenschap terechtgekomen? Broeckhoven: ‘Dat had vroeger vooral te maken met reproduceerbaarheid, maar nu eerder met de overdraagbaarheid van de methodes van labo naar labo. Elk instrument werkt een beetje anders, en er zijn heel veel variabelen. Denk aan de verhouding CO₂ -cosolvent, tegendruk, kolom- en tubelengte etc.’ De methode is ook veel minder ‘idiot proof’ dan gewoon LC. ‘Je moet aan veel meer dingen denken en dat schrikt nog een beetje af. Je moet echt weten wat je doet.’

Isomeren scheiden

Maar als je er eenmaal goed mee overweg kunt, gaat er een intrigerende wereld voor je open. ‘Als hoogleraar die werkzaam is aan de farmaciefaculteit heb ik veel onderzoek gedaan naar de bruikbaarheid van SFC in farmaceutische analyses, waaronder chirale scheidingen en het valideren van methodes in farmaceutische quality control’, vertelt Nováková. ‘Verder analyseerden we lipofiele vitamines in biologische materialen, aangezien je met SFC de vaak verschillende isomeren van zulke vitamines goed kunt scheiden.’ Daarnaast helpt SFC het veld van ‘lipidomics’ überhaupt: het zorgt voor de snelste scheiding van de lipideklasse tot nu toe.

Tegenwoordig ligt de focus van Nováková op de analyse van plantenmaterialen en meer fundamentele aspecten. Nováková: ‘We optimaliseren de koppeling van SFC aan massaspectrometrie. We bestuderen daarnaast wat het effect is van kolomgeschiedenis op analytische resultaten.’ Er zijn nog heel wat fundamentele dingen die nog niet goed begrepen zijn bij SFC, aldus Broeckhoven. ‘Neem bijvoorbeeld de drukopbouw. Bij LC warmt de kolom door de hoge druk op, maar een gas koelt dan juist af’, legt de Vlaamse hoofddocent uit. ‘Het probleem bij SFC is dat de temperatuur zowel kan stijgen als dalen, afhankelijk van de condities. Een superkritische vloeistof is ingewikkeld, dat kan beide de kanten op gaan.’

Twijfel

Naast fundamentele kwesties zijn er ook praktische zaken nog niet gunstig voor SFC. ‘De meeste SFC-instrumenten lopen op dit moment tot maar 400 bar, waar je bij een LC tot wel 1.500 bar kunt gaan’, vervolgt Broeckhoven. Die druk kan echter wel degelijk omhoog, weet Broeckhoven. ‘Op ons lab hebben we met een producent een LC-toestel ontwikkeld waarmee we tot 1.200 bar konden gaan in SFC en dat ging prima.’

Ook zijn er soms problemen met de systemen zelf. De scheiding in de kolom gaat dan wel goed, maar de andere onderdelen heffen die scheiding deels weer op. Alles moet daarnaast veel robuuster om de superkritische toestand te behouden. Broeckhoven: ‘Mensen twijfelen aan SFC. Daardoor wordt er minder geïnvesteerd, waardoor de incentives voor verdere ontwikkeling ontbreken. Het is een vicieuze cirkel, die zich in golven herhaalt.’

Nováková hoopt dat SFC een meer wijdverbreide techniek zal worden, ook al beseft ze dat dat best een moeilijk proces kan zijn. ‘De druklimieten die nu gelden, gooien natuurlijk een beetje roet in het eten. Maar je zou dat deels op kunnen lossen door bijvoorbeeld commercieel verkrijgbare core-shell deeltjes te gebruiken in de stationaire fase.’ Dé oplossing voor alle problemen met SFC – en de volledige chromatografische wetenschap – is volgens Nováková echter heel simpel: ‘Stay Fascinated by Chromatography!’ zegt ze met een lach.