“Het sequensen van eiwitten blijft een uitermate lastig proces. Dat werd onlangs pijnlijk duidelijk toen Amerikaanse onderzoekers beweerden dat ze eiwitten van de T. Rex hadden gesequenst om te onderzoeken of ze nog moderne familieleden hadden. Een van de geïdentificeerde peptiden in de Science-publicatie hebben ze moeten terugtrekken omdat het spectrum te onduidelijk was”, zegt Maarten Altelaar, postdoc bij de Biomolecular Mass Spectrometry and Proteomics Group van Albert Heck aan de Universiteit Utrecht.

Om snel eiwitten te kunnen sequensen, sloop je tegenwoordig niet meer de afzonderlijke aminozuren van een eiwit af – zoals met de Edman-reactie – maar ontrafel je de samenstelling via massaspectrometrie. Helaas levert dat vaak moeilijk interpreteerbare spectra op.

Voor een eiwit de massaspectrometer in kan, moet je het eerst met een enzym in behapbare peptiden knippen en die scheiden met vloeistofchromatografie. Die peptiden ioniseer je vervolgens door er een proton aan te hangen, bijvoorbeeld aan de NH2-groep, en ze in een massaspectrometer te analyseren die ze verder fragmenteert.

DUBBELE PIEKEN

Een van de gebruikte enzymen om het eiwit in fragmenten op te knippen is Lys-C. Het maakt selectief peptidebindingen ongedaan op elke plek in de eiwitketen waar het het aminozuur lysine aantreft. Lys-C maakt de knip in het eiwit altijd aan het carboxyluiteinde van lysine. Daardoor krijg je een peptidefragment met aan de ene zijde een ioniseerbaar amine-uiteinde voor in de MS en aan de andere zijde een lysineresidu en carboxylgroep.

Het probleem is echter dat dit lysineresidu zelf ook een functionele zijgroep heeft met een tweede NH2-groep, waardoor beide zijden van het peptide een – vrijwel even gemakkelijk – ioniseerbare NH2-groep bevatten. Aangezien de verdere afbraak in de massaspectrometer begint bij die geïoniseerde groep, kan die afbraak daardoor ook op twee manieren verdergaan, met alle interpretatieproblemen van dien.

Voor een eiwit van een organisme waarvan het genoom bekend is, hoeft een spectrum vol met dubbele en door elkaar staande pieken niet zo’n probleem te zijn. Daar biedt vergelijking met eiwitten en DNA-sequenties uit de database soelaas. Maar bij eiwitten van organismen zonder bekende genoomsequentie, het zogenoemde ‘de novo sequensen’, heb je weinig aan Lys-C.

De herontdekking van een bijzonder peptidase moet uitkomst bieden. “Ergens in de krochten van de wetenschappelijke literatuur vonden mijn collega’s Wilma Dormeijer en Shabaz Mohammed een artikel over een obscuur enzym, een Lys-N metalloendopeptidase, dat ooit geïsoleerd was uit de paddenstoel Grifola frondosa. Het knipt net als Lys-C naast lysine, maar precies aan de andere kant.” Zodoende komen beide aminegroepen – de N-terminus en de functionele groep van het lysineresidu – aan dezelfde kant van het peptide terecht. In de massaspectrometer kun je dit dubbel geladen peptide verder afbreken met Electron Transfer Dissociation (EDT).

Hiermee schiet je een elektron op het peptide af, waardoor deze lading verliest en verder fragmenteert. Omdat de overgebleven positieve lading de N-terminus verkiest boven de lisine-zijgroep, vindt de verdere fragmentatie vrijwel uitsluitend van daar af plaats, wat een makkelijker te interpreteren massaspectrum levert.

“Om te demonstreren dat Lys-N echt bruikbaar is voor de novo eiwitsequensing, stelde ik voor om bij de lokale slager een struisvogelsteak te halen”, vertelt Altelaar. “Daar is de genoomsequentie immers nog niet van bekend.” Samen met zijn collega’s isoleerde hij er verschillende eiwitten uit, en onderworp die aan het sequensingproces. Het leverde zoals verwacht duidelijke spectra op, met eigenlijk maar één soort ionen. “Het moet proteomics vanaf nu een stuk makkelijker maken.”

Bron: C2W Life Sciences 7, 4 april 2007