Met de nieuwe imaging-techniek VIRIM volg je het verloop van een virusinfectie gedetailleerder dan ooit. De trukendoos van een virus blijkt nog gevulder dan gedacht.

Een klein groen stipje onder de microscoop. Toen celbioloog Sanne Boersma dat lichtpuntje voor het eerst spotte, wist ze dat haar experiment geslaagd was. Met andere woorden: imaging-techniek SunTag – enkele jaren daarvoor ontwikkeld bij het Hubrecht Instituut, waar Boersma werkt als promovendus – is toepasbaar in virussen. De methode brengt kant-en-klare fluorescente eiwitten naar de plaats delict van een virusinfectie: het translerende en replicerende virale RNA.

Het betekent dat je de eerste stappen van een virusinfectie molecuul voor molecuul kunt volgen, live en in levende cellen. Het is de eerste keer dat onderzoekers dit proces zo gedetailleerd in beeld weten te brengen. Boersma en collega’s noemden de toepassing van SunTag VIRIM (virus infection real-time imaging) en publiceerden de bijbehorende paper in Cell.

Schatkist aan viruskennis

VIRIM is met name interessant voor positieve RNA-virussen. ‘Het RNA-molecuul van zo’n virus wordt direct nadat het de cel binnendringt gebruikt om eiwitten te produceren, dus je ziet meteen de eerste stip verschijnen’, vertelt Boersma. Pathogene RNA-virussen zijn bijvoorbeeld het hepatitis C-virus, het westnijlvirus en het zikavirus. Ook coronavirussen horen in dit rijtje. Boersma: ‘We hebben een schatkist aan viruskennis tot onze beschikking, omdat we nauw samenwerken met de onderzoeksgroep van moleculair viroloog Frank van Kuppeveld, hoogleraar bij de Universiteit Utrecht.’

‘Zodra een virusdeeltje een gastheercel betreedt, ontstaat er een gevecht’, vertelt Huib Rabouw, tweede auteur van de paper. Hij begon aan dit project als promovendus bij Van Kuppeveld en is inmiddels postdoc bij het Hubrecht Instituut, net als Boersma in het lab van Marvin Tanenbaum. ‘Het virus wil zich vervolgens zo snel mogelijk vermenigvuldigen, maar de cel probeert dit te voorkomen.’

VIRIM brengt die strijd stap voor stap in beeld. Rabouw: ‘Grofweg doen we twee dingen. Ten eerste zorgen we ervoor dat de gastheercel continu een specifiek antilichaam maakt dat gelabeld is met een groen fluorescent eiwit, GFP. Die antilichaam-GFP-moleculen ‘zwemmen’ door het cytoplasma van de cel. Ten tweede bevat het genetisch materiaal van het virus een code die SunTag-peptides tot expressie brengt tijdens de translatie. De antilichamen met GFP herkennen die peptides en binden eraan.’

VIRIM brengt tijdens de translatie van het virus een handjevol kant-en-klare fluorescente moleculen naar de plaats delict. De individuele GFPs in het cytoplasma zijn niet fel genoeg om onder de microscoop te zien, maar zo’n kluitje fluorescente eiwitten is dat wel. ‘Doordat we niet kijken naar de aanmaak van GFPs, maar naar de ophoping van al bestaande GFPs, is die assay veel gevoeliger dan andere analysemethodes’, zegt Rabouw.

‘Het duurt namelijk even voordat GFP fluorescent wordt. Als het erfelijk materiaal van het virus het eiwit zelf moet produceren, is het translatieproces allang voltooid als het GFP eindelijk oplicht. Het zit dan niet meer aan het RNA vast, maar drijft ergens rond in het cytoplasma. Daarnaast is het voor veel bestaande technieken noodzakelijk om meerdere cellen op een hoop gooien om überhaupt een signaal waar te nemen. Je middelt dan alle subtiele kinetiek eruit die we met VIRIM wel kunnen meten.’

Ideaal evenwicht

De methode is zeer waarschijnlijk toepasbaar in alle positieve RNA-virussen, maar je moet haar wel telkens optimaliseren. Rabouw: ‘Virussen krijgen niet graag extra genetisch materiaal door hun strot geduwd. Als de extra RNA-code niet bevalt, recombineert een virus die er zo weer uit.’ Maar hoe minder genetisch materiaal je toevoegt, hoe minder SunTag-peptides het virus maakt en er fluorescente eiwitten aan de plaats delict kunnen binden. Dat maakt analyseren dus lastiger. ‘We moeten voor ieder virus zoeken naar het ideale evenwicht tussen een sterk genoeg signaal en een acceptabel genoom voor het virus.’

Voor dit onderzoek gebruikte Boersma Coxsackievirus B3, een relatief onschuldig RNA-virus uit de picornavirus-familie dat in de meeste gevallen een milde verkoudheid veroorzaakt. Via een livestream van microscopiebeelden zag ze hoe het virus de gastheercel meester maakte. ‘We konden verschillende fases van de infectie onderscheiden’, vertelt Boersma.

‘Het eerste groene stipje luidt fase 1 in, waarin het binnengedrongen virale RNA middels translatie eiwitten maakt. Tijdens fase 2 verdwijnt de stip even; de translatie ligt stil en de replicatie, ofwel het kopiëren, van het virale RNA start. Vervolgens gaan de nieuw gesynthetiseerde RNA’s transleren en repliceren – fase 3, 4 en 5 – goed voor tientallen groene stipjes op de livestream.’

Het virus heeft nu succesvol zijn erfelijk materiaal in de gastheercel gebracht en de machinerie van de cel gegijzeld. De cel wordt gedwongen zijn fabriek te gebruiken om nieuwe virusdeeltjes te produceren. ‘Als dat lukt, is de infectie geslaagd. Het virus wint, de cel is verloren’, zegt Boersma. ‘Gelukkig heeft het immuunsysteem dan nog enkele andere trucs achter de hand om het virus te bestrijden, maar voor de geïnfecteerde cel is het gedaan.’

VIRIM onthult hoeveel lef virussen eigenlijk hebben, meer dan voorheen gedacht. Boersma: ‘We kwamen erachter dat een virusdeeltje al een paar minuten nadat het de gastheercel betreedt, in zijn eentje probeert de eiwitproductie van de cel te ontregelen. Het virus blijft al die tijd onder de radar voor de cel, want die start pas een tegenaanval als de vijand voor het eerst gaat repliceren tijdens fase 2. Dit betekent dat de wapenuitrusting van de gastheercel – hoe sterk die ook is – geen invloed heeft op de translatie van het eerste RNA-molecuul (fase 1, red.).’

‘Het virus heeft dus even de tijd om eiwitten te maken, inclusief eiwitten die de antivirale respons tegengaan’, vult Rabouw aan. ‘Dat doet het dus met slechts één RNA-molecuul. Blijkbaar is het virus zo efficiënt dat het met enkele tientallen eiwitten de gehele wapenuitrusting van de cel kan platleggen, voordat die ook maar de kans krijgt om op de indringer te reageren.’

Kwetsbaar moment

De cruciale eerste stappen van de infectie waren voor de komst van VIRIM een soort black box. ‘Dankzij de assay weten we dat fase 2 de achilleshiel van het virus is, want op dat moment kan het zich niet meer verstoppen voor de gastheercel’, zegt Boersma. Rabouw: ‘Die eerste replicatiestap is het kwetsbaarste moment, ideaal dus om antivirale therapieën specifiek op te richten.’

Om dit alvast uit te proberen, lieten de onderzoekers een aantal remmers los op het proces, die voorkomen dat er nieuwe RNA-moleculen worden gemaakt. ‘We zagen toen iets onverwachts’, zegt Boersma. ‘Het lampje ging soms weer aan. Met andere woorden: het RNA-molecuul werd na uitschakeling opnieuw actief. Blijkbaar heeft het virus een soort back-up achter de hand als het er niet meteen in slaagt te repliceren. De kleine slimmerik probeert het even later gewoon opnieuw.’

Bijschrift bij afbeelding: Livebeeld van geïnfecteerde cellen. Nadat een virus een gastheercel heeft geïnfecteerd, probeert het te vermeerderen (groen) en te voorkomen dat de gastheercel zich bemoeit met de virusreplicatie door de celkern aan te vallen (blauw) en de eiwitproductie van de gastheercel stil te leggen (rood).