RNA-interferentiemethode met lange dubbelstrengs RNA in Drosophila, blijkt niet nauwkeurig

RNA interferentie-experimenten in Drosophila cellen met lange dsRNA-moleculen zijn niet geheel specifiek. Dit blijkt uit twee onderzoeken, gepubliceerd in Nature en Nature Methods. Door ‘off-target effects’ (OTE’s) worden de verkeerde genen geïnactiveerd.

Bij RNAi worden de van genen afgeschreven mRNA’s uitgeschakeld met behulp van ingebrachte, gesynthetiseerde stukjes RNA. Het aspecifiek functioneren van korte stukjes RNA, is een erkend probleem bij dit proces. Genoombrede Drosophila RNA-bibliotheken gebruiken daarom dsRNA’s die honderden basenparen lang zijn. Door de aanwezigheid van op elkaar lijkende (homologe) gebieden in het genoom, kunnen korte RNAi-moleculen willekeurig aan verschillende RNA’s binden. Bij langere RNA-moleculen is er een grotere basenparing nodig voor het stabiel binden, waardoor ze specifieker zullen binden.

Yong Ma, hoofdauteur van het Nature artikel en werkzaam bij het Johns Hopkins University school of Medicine, en collega’s ontdekten tijdens het screenen van een dsRNA-bibliotheek van 21.000 moleculen, zeven moleculen die een waarneembaar interferentieresultaat gaven. De zeven dsRNA’s leken te werken op zeven genen betrokken bij een signaaltransductieroute. De groep maakte vervolgens nieuwe, specifieke dsRNA-moleculen tegen de gevonden genen. Alleen de dsRNA’s die, op specifieke gebieden, dezelfde sequentie hadden als de originele, actieve RNA-moleculen leverden het verwachte resultaat.

De originele dsRNA´s, hadden korte sequenties, van korter dan 20 basenparen, homoloog aan sequenties van een gen dat een rol speelt in de signaaltransductieroute. Via deze homologie konden de verschillende dsRNA´s allemaal de mRNA- en eiwitconcentraties, geproduceerd door het ene gen, verlagen. De biomoleculen leken zo via aspecifieke werking op het gen, dat niet hun beoogd doel was, het waargenomen resultaat te leveren. Uit een andere opnieuw geanalyseerde screen bleek ook dat de reactieve dsRNAs, sequentiehomologie met elkaar vertonen. Via OTE’s lijken ze op dezelfde doelen te werken en tot hetzelfde eindeffect te leiden.

In Nature Methods, beschrijft Norbert Perrimon bewijs voor het bestaan van OTEs na het heranalyseren van 30 screens. ‘Het contamineert je data, want je krijgt wat je wilt krijgen plus nog rommel’, aldus Perrimon, werkzaam aan het Harvard Medical School.

Perrimon en Ma raden aan om RNA-bibliotheken te ontdoen van dsRNA met een significante homologie met andere doelen. Verder zou de activiteit van reactieve dsRNA’s gevalideerd moeten worden met niet-overlappende dsRNA’s voor dezelfde doelen.

bron: The Scientist, Nature (10 sep. 2006)