Single cell RNA-sequencing is sinds 2016 uitgegroeid tot een standaardtechniek. Internationale consortia bouwen aan referentieatlassen van organen en tumoren, waarvoor ze vele miljoenen cellen karakteriseren. Single cell-diagnostiek komt zo geleidelijk binnen bereik.

Een cel heeft een piepklein volume, en toch kunnen onderzoekers tegenwoordig in één dag de genexpressie van tienduizenden individuele cellen in kaart brengen. Dat betekent concreet circa 200.000 RNA-kopieën per cel sequencen, afkomstig van vele duizenden genen. Dankzij cell sorters, pipetteerrobots, lab-op-chip-apparatuur en goedkoop sequencen is dat proces inmiddels zo ver doorontwikkeld dat de analysekosten tot onder de euro per cel zijn gedaald. Voor dat geld wordt het RNA in de een cel voorzien van een genetische barcode, in vitro vermeerderd en uitgelezen.

‘Die stapeling van moleculaire technieken levert een flinke sprong vooruit in het onderzoek’, zegt Diether Lambrechts, hoogleraar humane genetica bij het VIB-KU Leuven Center for Cancer Biology. Onderzoekers kunnen eindelijk in kaart brengen welke celsoorten in een weefsel zitten. ‘Zo zijn tumoren altijd heterogeen. Er zitten uiteraard tumorcellen in, maar die verschillen vaak onderling in een aantal mutaties. Daarnaast zijn er zogenoemde stromale cellen aanwezig: bloedvaten, afweercellen, bindweefsel. Het is dus heterogeniteit alom.’

Een smoothie van cellen

Voorheen namen onderzoekers een biopt met tienduizenden cellen, die ze homogeniseerden en genetisch analyseerden. Het beeld dat daaruit kwam was een soort gemiddelde, een ‘smoothie’ van tientallen verschillende soorten cellen. ‘Als je op die manier RNA of DNA bekijkt, weet je niet van welke cel het afkomstig is. Dat is de grote kracht van single cell sequencen, je kunt alle heterogeniteit in de tumor cel voor cel in kaart brengen.’

Zo heeft Lambrechts’ lab de transcriptieprofielen van 52.000 stromale cellen uit 1.572 longtumoren geïnventariseerd. Het levert een staalkaart van 52 verschillende celtypes. ‘Het stroma is een minstens zo belangrijk doelwit als de tumorcellen. Er zijn bijvoorbeeld anti-angiogene therapieën, die bloedvatvorming in de tumor tegengaan. En tumoren waarin veel T-cellen zitten zijn vaak minder agressief, terwijl de toestand van de T-cellen bepalend is voor de reactie op immuuntherapie. Die informatie is dus behulpzaam bij het vinden van effectievere behandelingen.’

Volgens Lambrechts leent single cell-technologie zich er bij uitstek voor tumoren door de tijd te volgen; voor en tijdens antitumortherapie. Op die manier kun je de evolutie van de tumor in beeld brengen: sommige celsoorten verdwijnen geleidelijk, terwijl andere juist de kop opsteken. ‘Twee jaar geleden zijn we begonnen met weefsels in de tijd te verzamelen. Dat soort seriële analyses leveren fraaie data op. We proberen met single cell-analyse te achterhalen wat er gebeurt, en zo genetische merkers te vinden die later in de patiëntenzorg zijn te gebruiken.’

Lambrechts meent dat referentiedata onmisbaar zijn om single cell-analyses te begrijpen. Er zijn verschillende atlasinitiatieven, zoals de Human Cell Atlas en Human Tumor Atlas, bezig weefsels op celniveau te karakteriseren. Zulke atlasprojecten vinden ook plaats voor modelorganismes zoals muis, fruitvlieg en zebravis. Lambrechts: ‘Dat levert een celencyclopedie. Zulke referenties met publieke toegankelijke data gaan een belangrijke rol spelen in het onderzoek. Je kunt dan nieuwe onderzoeksgegevens van een patiënt snel vergelijken met grote datasets.’

Onlinedata

Single cell-bestanden delen leidt nu al tot nieuwe in-silico-analyses. ‘Het mooie is dat veel sequencing-data tegenwoordig online beschikbaar zijn. Daar kun je een nieuwe onderzoeksvraag op loslaten’, zegt Bart Westendorp, universitair docent bij de afdeling pathobiologie van de faculteit diergeneeskunde, en manager van het Single Cell Analysis Center Utrecht.

Westendorp wil onder meer beter begrijpen waardoor tumoren ondanks DNA-schade blijven delen. Normaal gesproken is DNA-schade een stopsignaal in de celcyclus, en E2F-transcriptiefactoren regisseren dat controlesysteem. ‘Als een cel een delingscyclus doorloopt, zie je dat het E2F-programma aan- en uitschakelt. De activiteit varieert dus tussen delende en rustende cellen.’

Er zijn wel aanwijzingen dat de activiteit van E2F in tumorcellen is verstoord, maar E2F is in elk weefsel te meten, zeker in snelgroeiende tumoren, aldus Westendorp. ‘Als je een biopt onderzoekt, zitten er ook immuuncellen en bloedvatcellen bij, wat het beeld vertroebelt. In een single cell-dataset van tumorbiopten kun je de tumorcellen van andere cellen goed onderscheiden. Verder kun je de cellen groeperen op fase in de celcyclus: of ze op het punt staan te delen, of in rust zijn. Zo kun je een eerlijke vergelijking maken om te zien of in tumorcellen de E2F-pathway altijd harder aanstaat. Dat blijkt inderdaad het geval.’

Met die kennis ging Westendorps promovendus Jet Segeren verder in het lab, met cellijnen waarin verschillende E2F-genen zijn uitgeschakeld of juist opgevoerd. Met fluorescente merkers en flow-cytometrie zijn die cellen netjes op celcyclusfase gesorteerd en vervolgens onderzocht op genexpressie met single cell-analyse. Zo kun je de genexpressie van cellen die in rust of G1-fase zijn vergelijken met cellen in G2-fase, dus vlak voor de deling, aldus Westendorp.

‘We kunnen cellen tijdens de celcyclus volgen en zien hoe ze op DNA-schade reageren. Een normale cel zet de celcyclus na de S-fase stop om DNA-schade te repareren, en als dat niet lukt gaat hij definitief in rust. Als E2F te hard aanstaat, gaan cellen eerder door. Zo ontstaan er geleidelijk steeds meer mutaties en genomische instabiliteit, die bijdragen aan uitzaaiingen en resistentie tegen behandelingen. Als E2F-genen harder aanstaan, zien we in celkweek dat er meer van het DNA-beschadigende cisplatina nodig is om cellen te laten stoppen met delen. Ontregeling van E2F maakt de cel dus ongevoeliger.’

Labstudies en beter begrip van dit mechanisme leveren volgens Westendorp nieuwe aanknopingspunten om te kijken naar patiënten. ‘Je kunt gaan onderzoeken of patiënten met een amplificatie van E2F-genen minder goed reageren op cisplatina-behandeling.’

Single cell-snapshot

Een ander idee van Westendorp is om single cell-data te gebruiken om tumorgroei te voorspellen. ‘Zo ver zijn we nog niet, maar ik denk wel dat het die kant uitgaat. We zijn bezig om met in-vitrodata een computermodel te bouwen dat rekent aan de balans van stervende en delende cellen, om iets te zeggen over de groeisnelheid van de tumor. Zo kun je voorspellen of de behandeling langdurige remissie oplevert. Een single cell-snapshot van de tumor geeft dan informatie die een arts kan gebruiken om te beslissen over bijvoorbeeld dosering of combinatie van middelen.’

Single cell-analyse vertalen in gepersonaliseerde behandelingen staat ook boven aan de wensenlijst van Mauro Muraro, directeur van Single Cell Discoveries (SCD) uit Utrecht. Zijn bedrijf kwam in 2018 voort uit een servicelab van de groep van Alexander van Oudenaarden bij het Hubrecht Instituut in Utrecht. Bedrijven en academische groepen kunnen via SCD single cell-analyses toepassen, zonder de apparatuur en expertise in huis te hoeven halen.

Muraro: ‘Diagnostiek blijft het ultieme doel. Je wilt met deze techniek van beschrijven naar voorspellen en behandelen. Het is nog toekomstmuziek, maar uiteindelijk wil je een beetje bloed of tumorweefsel van een patiënt nemen om te kijken welke subpopulaties aanwezig zijn. Om daar vervolgens de behandeling op af te stemmen.’

Celatlas voor tumoren

Onlangs werd bekend dat SCD gaat meewerken aan een internationaal project dat een celatlas verschillende vaak voorkomende tumoren. Het bedrijf werkt al aan een specifieke celatlas voor CLL, een veelvoorkomende bloedtumor die ontstaat door ongecontroleerde vermeerdering van B-cellen. Met financiering van Health Holland is het de bedoeling de (sub)types B- en T-cellen in kaart te brengen.

De CLL-atlas wordt een referentie om te onderzoeken of je aan de hand van single cell-data wat kunt zeggen over de uitkomst van behandeling. Muraro: ‘Met zo’n atlas zou je in een vroeg stadium therapieresistente tumorcellen kunnen signaleren. Die cellen zijn in het begin vaak zeldzaam, maar na de behandeling gaan ze domineren. Je kunt dan hopelijk meer zeggen over welke resistente B-cel-klonen de overhand zullen krijgen, en wat de meest kansrijke behandeling is.’

SCD doet grootschaliger analyses en atlasprojecten op 10X Genomics-apparatuur. Die gebruikt een microfluidics-chip om cellen stuk voor stuk in microscopische druppeltjes op te sluiten, samen met een RNA-barcode en amplificatie-reagentia. Op één apparaat kun je achtmaal 10.000 cellen parallel verwerken. Het sequencen van het cDNA dat hieruit komt, vindt plaats bij een gespecialiseerd sequencingbedrijf. Dat stuurt vervolgens meerdere terabytes aan data retour. SCD verwerkt de data, zodat je er biologische conclusies uit kunt trekken.

Fundamentele onderzoeksvragen

Witte bloedcellen hebben een prettige eigenschap, ze zitten namelijk al los in suspensie. Muraro: ‘Met sommige solide tumoren zijn onderzoekers zeven uur bezig om een celsuspensie te maken. Dat zie je zo nu en dan terug in de kwaliteit van de data. Daarom doen we meestal eerst kleinere pilotexperimenten met enkele honderden cellen, om te zien of we de extractieprocedure nog kunnen verbeteren. Vervolgens kun je bepalen hoeveel cellen je moet analyseren om je vraag te beantwoorden.’

Onderzoek met patiëntmateriaal is overigens niet het enige waarvoor je single cell-technologie tegenwoordig inzet, aldus Muraro. De onderzoeksvragen die SCD krijgt, zijn ook veel breder en fundamenteler: van stamcelbiologie en neurobiologie tot evolutie. Zo onderzoekt het bedrijf veel organoïden, ofwel mini-orgaantjes uit celkweek. De eerste vragen zijn daarbij vaak welke celsoorten erin zitten en of die vergelijkbaar zijn met het oorspronkelijke orgaan. ‘In twee jaar tijd hebben wij cellen onderzocht van meer dan twintig verschillende soorten organismes; van muizen, via fruitvlieg tot zebravis. We hebben zelfs organoïden uit de klieren van gifslangen geanalyseerd.’

Als je wilt weten welke celtypes in een weefsel zitten – in dit geval een plantenwortel – dan kan single cell RNA-sequencing snel meer inzicht verschaffen. Eerst breek je het weefsel op in losse cellen. Die sluit je in een microfluidic-chip stuk voor stuk op in een oliedruppeltje met microscopische deeltjes, ofwel beads, met primers. Elke bead heeft een unieke genetische barcode. Terwijl het RNA uit de cel wordt vertaald in cDNA wordt zo een uniek stukje code toegevoegd. Na sequencen is elke RNA-volgorde daaraan te herkennen, en kun je ze groeperen naar de cel waaruit ze afkomstig zijn. Op die manier maken onderzoekers een single cell-transcriptoom van duizenden cellen tegelijk. (Bron afbeelding: Rich-Griffin C. et al (2020). Trends Plant Sci. 25(2): 186)