De ontwikkeling en verfijning van sequencingtechnieken houdt de producenten van analyseapparatuur nog immer bezig. De nieuwste generatie belooft een verdubbeling van de maximale leeslengte, en productietoenames met een factor vijftig.

Honderd menselijke genomen sequencen binnen tien dagen? De Amerikaanse X-Prize Foundation, ook bekend als sponsor van de toeristische ruimtevaart, heeft tien miljoen dollar klaarliggen voor de eerste niet-overheidsorganisatie die het voor elkaar krijgt. Hoe groot is de kans dat deze prijs er binnen afzienbare tijd uit gaat?

Honderd genomen, dat zijn ruim driehonderd miljard basenparen (bp). Om de prijs te winnen, moet je bijna anderhalf miljard bp per uur kunnen verwerken. Het is te doen, al zou de apparatuur een veelvoud van die tien miljoen dollar kosten. Maar het is nog niet zo lang geleden dat het pure sciencefiction leek.

32 LAANTJES

De eerste bruikbare sequentiemethodes, Maxam-Gilbert en Sanger, dateren van eind jaren zeventig. De Sangermethode groeide uit tot de populairste van de twee (zie kader pagina 67). “In het begin kon je zes tot acht monsters analyseren in 32 laantjes”, vertelt Ronald Bergkamp. Je haalde leeslengtes van rond de 100 tot 200 basenparen.” Bergkamp is teamleider Molecular Biology Support in de Benelux van Applied Bio­systems, een pionier op sequencinggebied. “Met de eerste gel-based sequencers die wij toen op basis van de Sangermethode hebben ontwikkeld, kon je zestien monsters overnacht analyseren”, herinnert hij zich. “Een run duurde dan ongeveer zestien uur en de geanalyseerde stukken DNA hadden een lengte van driehonderd tot vierhonderd basenparen.”

Bij de originele methode was vooral het analysewerk tijdrovend. “Zoals gel gieten, monsters opbrengen en gels runnen. De eerste sequencer van Applied Bio­systems maakte de methode al veel tijdseffectiever door fluorescente labels met verschillende kleuren te gebruiken, die aan de dideoxynucleotiden werden gebonden. Voortaan kon de synthesereactie in één mix plaatsvinden en kon je op de gel een monster per laantje analyseren. Toen was het mogelijk om in drie uur tijd zestien monsters met een lengte van vijfhonderd bp te verwerken.”

CAPILLAIR

De introductie van capillaire sequencers betekende een grote stap voorwaarts. Ze automatiseerden het hele proces. Eerst wordt de sequencingreactie ingezet, een standaard Sangerreactie met vier fluorescente labels. Na opzuivering van de reactiemix waarbij de niet-gebonden dideoxynucleotiden worden verwijderd, wordt het DNA in een capillair gescheiden.

In het capillair bevindt zich een vloeibaar polymeer waar de stukken DNA zich doorheen bewegen, gedreven door een potentiaalverschil van rond de 15 kV. De kortste stukken DNA lopen het snelst. Bij de uitgang van het capillair zit een laser, die de fluorescente labels aanslaat. Aan de hand van het spectrum, dat elk aangeslagen label uitzendt, is het ketenbeëindigende dideoxynucleotide te herkennen dat eraan vastzit. Een sensor vangt het licht op, waarna software het omzet in een piekenpatroon. Daaruit is uiteindelijk de complete sequentie af te leiden.

De eerste machine had één capillair dat, net als bij gel-based sequencing, in drie uur tijd een sequentie van 500 bp kon verwerken. Tegenwoordig bestaan er sequencers met 96 capillairen, die ongeveer twee uur nodig hebben om 96 monsters van elk ongeveer 800 bp te sequencen. Er zijn ook langere capillairen die DNA met een lengte van 1.000 bp kunnen verwerken in drieënhalf uur tijd. De snelste machines kunnen in totaal ongeveer 2,1 miljoen basen aflezen binnen 24 uur. “Qua scheiding is het niet veel anders dan de gel-based sequencers”, zegt Bergkamp. “Het grote verschil zit in het aantal handelingen dat je nog moet uitvoeren.” Hij denkt dat de capillaire techniek nu wel volledig uitontwikkeld is, maar vanwege de superieure leeslengtes voorlopig zal blijven bestaan.

Dit beaamt Nicole Wellens, sales specialist bij Isogen Life Sciences. Ze ziet capillaire sequencing als de beste huidige methode, zeker voor stukjes DNA van tussen de 500 en 1.000 bp. Het hangt ook wel af van de toepassing, vult ze aan. “Voor de volgende grote ontwikkeling in sequencing moet je naar een volgende generatie.”

MASSIEF PARALLEL

Tot de nieuwe generatie behoort de massief parallele pyrosequencingtechniek, die het bedrijf 454 Life Sciences heeft ontwikkeld. Het Koninklijk Nederlands Instituut voor Onderzoek der Zee (NIOZ) op Texel en het Marine Biological Laboratory in Massachusetts gebruiken de methode om de microbiële diversiteit van de oceanen in kaart te brengen. Zowel monstervoorbereiding als de daadwerkelijke sequencing gaan hierbij veel sneller. De stukken DNA worden niet in bacteriën vermenigvuldigd, maar gebonden aan kraaltjes (de zogeheten beads) in een oplossing.

Elke bead krijgt zijn eigen streng DNA. Na vermenigvuldiging van het DNA, worden de beads overgebracht naar een pico­titerplaat met 1,6 miljoen gaatjes. In deze ‘welletjes’ vindt dan de pyrosequencing­reactie plaats. Er stroomt een reactiemix doorheen met enzymen en beurtelings een van de vier basen. Het inbouwen van een specifieke base gaat samen met een lichtflits die een sensor opneemt. Het kost zo ongeveer vijf uur om rond de 20 miljoen basen te sequencen. Het gaat om stukken DNA van 100 bp.

Roche heeft vorig jaar de 454-techniek op de markt gebracht. Hans Lunstroo, key account manager genome sequencing bij Roche, is er enthousiast over. Hij geeft aan dat volgend jaar een machine op de markt komt die stukjes van 200 bp aankan, dankzij optimalisatie van de gebruikte enzymen en de chemie. “Door de hoge doorvoer van de nieuwe generatie sequencers is meer mogelijk”, aldus Lunstroo. “In korte tijd kun je een compleet bacterieel genoom sequencen.” Een groot voordeel is dat het niet meer nodig is DNA in bacteriën te kloneren. “Sanger-sequencing kan maanden in beslag nemen. Met massief parallel pyrosequencing kan het in weken gebeuren.”

APPLICATIEGERICHT

Capillaire sequencing is nog niet afgeschreven. Volgens Mark van Haaren moet je het ene doen en het andere niet laten. Hij is manager business development bij Keygene. Dat bedrijf past beide technieken toe bij moleculair genetisch onderzoek naar onder meer plantenveredeling. Zo is de capillaire techniek handig om specifieke genen te analyseren, terwijl pyrosequencing de aangewezen methode is om hele genomen te analyseren en te vergelijken op het voorkomen van sequentievariaties via Keygene’s CRoPS-technologie. Die complexiteit reducerende methode combineert een door Keygene ontwikkelde DNA-fingerprinttechnologie met de 454-techniek om zo representatieve delen van grote genomen te amplificeren voor ze te vergelijken.

In de toekomst zal voor de pyrosequencingtechniek het aantal DNA-moleculen en de lengtes van de moleculen blijven toenemen, speculeert Van Haaren. Alleen homopolymeren, stukjes DNA met herhaalde kopieën van een specifieke base, blijven volgens hem nog een probleem. Tijdens het pyrosequencingsproces kunnen die namelijk leiden tot onnauwkeurigheden. “Voor de CRoPS-technologie is hiervoor eenvoudig te corrigeren. Maar bij de novo sequentiebepaling moet hier wel degelijk rekening mee worden gehouden.”

KOSTENEFFECTIVITEIT

Johan den Dunnen, universitair hoofddocent bij Humane en Klinische Genetica en hoofd van het Leiden Genome Technology Center binnen het LUMC, ziet ook geen nut in het vergelijken van pyro­sequencing met capillaire sequencing. “De techniek die je gebruikt, hangt af van wat je wilt onderzoeken.” Hij maakt wel onderscheid tussen massief parallelle en niet-massieve pyrosequencing. Bij de niet-massieve versie kunnen er 96 monsters tegelijkertijd worden gesequenced met een snelheid van 1 bp per minuut. “Die techniek leent zich het best voor het zien van kleine verschillen tussen twee stukjes DNA”, vertelt hij. Bij het ontrafelen van één enkele, lange sequentie is capillaire sequencing dan weer handiger.

Ook de kosteneffectiviteit van de methodes speelt een rol bij de keuze. Den Dunnen vertelt dat de klassieke pyro­sequencing tien keer duurder is dan

capillaire sequencing, maar dat massief parallelle pyrosequencing omgerekend weer een factor duizend goedkoper is. In de ogen van Wellens is niet massieve pyro­sequencing een echte applicatiegerichte ontwikkeling. Ze geeft aan dat de methode voordelen heeft bij kortere stukjes DNA en bij specifiek onderzoek zoals het onderzoek naar microbiële diversiteit. Maar zij ziet pyrosequencing ook niet direct als een vervanging van capillaire sequencing, maar eerder als een aanvulling, juist vanwege de lengtebeperkingen.

STAP VOOR STAP

Gevraagd naar hoe het veld zich moet gaan ontwikkelen antwoordt Den Dunnen: “Sneller, goedkoper, meer.” Bij hem op het lab gebruiken ze nu nog voornamelijk capillaire sequencing, maar zijn groep is van plan om de nieuwste massief parallele sequencer van Solexa aan te schaffen en breed in te zetten. Solexa’s techniek zal een sequencing by synthesis-benadering gebruiken. Bij die techniek worden DNA-fragmenten via adapter­moleculen gehecht aan een oppervlak en vervolgens vermenigvuldigd met normale basen. Dit levert clusters van stukjes DNA met dezelfde sequentie. Dan begint de sequencingreactie met behulp van primers, enzymen en speciale, gelabelde nucleotiden. Net als bij de Sangerreactie hebben die alle vier een ander fluorescent label, en zorgen ze na het inbouwen voor het stopzetten van de ketensynthese.

Het label wordt weer aangeslagen met een laser, waarbij een sensor het licht opvangt. Maar vervolgens worden de labels en de blokkering van de ketens verwijderd, waarna de volgende speciale base zich kan binden. De stukken DNA worden op deze manier dus stap voor stap afgelezen, waardoor het probleem met de homopolymeren wordt omzeild. De leeslengte zal aanvankelijk rond de 25 à 30 bp liggen. “Met deze techniek zul je 10 tot 40 miljoen stukjes DNA tegelijkertijd kunnen sequencen’, voorspelt Den Dunnen.

Ook Applied Biosystems introduceert volgend jaar een nieuwe massief parallelle techniek. Deze SOLID-techniek (Supported Oligo Ligation Detection) zal een doorvoer van 100 miljoen basen per 24 uur hebben. Bergkamp: “Ik ben ervan overtuigd dat dit de meest populaire techniek voor massive parallel sequencing wordt.”|