Een nieuwe manier van fossielen analyseren aan de hand van bewaard gebleven eiwit levert opmerkelijke inzichten. Zo is onlangs een pas ontdekte mensachtige, de Denisovan, geïdentificeerd door analyse van een 160.000 jaar oude kaak. Maar in dit nieuwe vakgebied, paleoproteomics, is nog veel meer gaande.

Soms heb je geluk in de wetenschap. Een paar jaar geleden benaderde een Chinese onderzoeksgroep de Nederlandse moleculair archeoloog Frido Welker, die toen bij het Max Planck Institute for Evolutionary Anthropology in Leipzig werkte. De Chinezen hadden een stuk onderkaak gevonden van zo’n 160.000 jaar oud op het Tibetaanse plateau en ze wilden weten van welke mensensoort die afkomstig was. DNA-analyse was geen optie; al het DNA was vergaan. Welker en zijn collega’s hadden een alternatieve methode beschikbaar: de analyse van oude eiwitten zoals collageen, die wél in het bot bewaard waren gebleven.

Grote impact

Eiwitsequenties, zoals die van collageen, zijn genetisch bepaald en verschillen dus per soort. Hoewel de verschillen niet groot zijn, wees de eiwitsequentie die Welker vaststelde erop dat het bot niet aan een Neanderthaler of andere moderne mens toebehoorde, maar aan een Denisovan, een mensachtige die nog maar net ontdekt was. Het was de eerste keer dat een fossiel van een mensachtige is geïdentificeerd met eiwitsequenties. ‘Het was een gelukje om met dit fossiel te kunnen werken. Dit geeft de impact aan die dit soort analyses voor de antropologie kan hebben als er zelfs geen DNA is’, zegt Welker, die momenteel postdoc is aan de universiteit van Kopen­hagen.

Matthew Collins, hoogleraar palaeoproteomics in Kopenhagen en Cambridge, was begin jaren negentig als onderzoeker aan de Universiteit Leiden een van de grondleggers van dit vakgebied. Hij noemt het de heilige graal; het vaststellen van de menselijke stamboom. ‘Analyse van oude eiwitten kan hier echt een groot verschil maken.’

Ethisch dilemma

Welker, Collins en een handvol andere onderzoekers gebruiken moderne proteomics­technieken om oude eiwitten te analyseren. Collins ontwikkelde Zoo-archaeology by Mass Spectrometry (ZooMS) als een goedkope manier om veel samples met collageen type 1 te analyseren. Met die methode op basis van Maldi-TOF-MS kun je heel snel duizenden botfragmenten screenen voor een taxonomische identificatie – behoort het bot aan een mens of dier? Maar meestal zijn onderzoekers geïnteresseerd in de eiwitsequentie, die je met LC-MS/MS bepaalt, net als in moderne proteomics.

‘Analyse van oude eiwitten kan een groot verschil maken’

Die analysetechnieken betekenen wel dat het fossiele sample verloren gaat. Dat is inderdaad een ethisch dilemma, aldus Welker. ‘Het is geen stuk speelgoed, we werken met fossielen die uniek zijn voor de evolutie van de mens. Menselijke fossielen hebben vaak ook een emotionele of symbolische waarde. Daarom is het essentieel dat we samenwerken met de mensen die het fossiel hebben gevonden.’

Een van de manieren om hiermee om te gaan, is een klein gaatje boren in het bot en aan de binnenkant een sample nemen. Daarna kun je het bot nog gewoon tentoonstellen. Een andere mogelijkheid die Welker veel toepast, is eerst een uitgebreide analyse doen van stukjes bot die geen culturele waarde hebben, zoals piepkleine fragmenten of botten van dieren. Uit dat onderzoek rollen ook al heel interessante resultaten. Zo analyseerde hij samen met collega’s twee miljoen jaar oude botfragmenten van een neushoornsoort uit Georgië, gevonden op een plek waar ook een van de eerste menselijke fossielen buiten Afrika is gevonden. ‘Uit dat onderzoek blijkt dat eiwitten inderdaad bewaard zijn gebleven. Daarbij hebben we geen collageen, maar de eiwitten in tandglazuur geanalyseerd. Daar is veel minder van, maar het bevat wel meer informatie, zoals het geslacht van het dier. Met dit onderzoek tonen we aan dat het zinvol is om ook menselijke fossielen van die plek te onderzoeken.’

Complexe degradatie

Een van de grote uitdagingen bij de analyse van oude eiwitten is de veranderingen die ze ondergaan in de loop van de tijd. Er zijn veranderingen die al in het levende organisme plaatsvinden, de post-translationele modificaties (PTMs), zoals fosforyleringen of methyleringen. Daarnaast speelt de omgeving waarin het fossiel bewaard is een rol. Eiwitten degraderen voornamelijk door bijvoorbeeld warmte en vocht en de PTMs degraderen mee. ‘Dat is een verschil met moderne proteomics. Die ei­witten zijn vaak niet, of minder, gedegradeerd’, zegt Welker. ‘Al bij het ontwikkelen van extractiemethodes moeten wij rekening houden met alle mogelijke modifi­caties.’

Daarnaast is de identificatie van soorten op basis van de eiwitsequenties veel lastiger als die eiwitten onderweg gemodificeerd zijn. Dat gebeurt aan de hand van een vergelijking met databases, maar dan moeten de modificaties daarin wel opgenomen zijn. Bovendien zijn eiwitsequenties van uitgestorven diersoorten vaak helemaal niet bekend, zodat databases minder bruikbaar zijn. Welker gebruikt daarvoor de novo sequencing, waarbij software de fragmenten in het massaspectrum identificeert.

Het oudste eiwit tot nu toe gemeten is een 3,8 miljoen jaar oude eierschaal

Een andere grote uitdaging is vervuiling, aldus Collins. ‘Meer dan met DNA is elk lab, alle apparatuur, vervuild met moderne eiwitten. Soms dragen onderzoekers wollen truien of latexhandschoenen.’ Hij heeft smakelijke voorbeelden van missers in onderzoek. ‘Een student zocht naar oude eiwitten in een sample uit de IJzer­tijd in Duitsland en vond het Krim-Congo­-virus. Een bijzondere vondst, want dit virus komt normaal alleen in warmer klimaat voor. Misschien had een individu dit virus bij zich gedragen op reis naar Duitsland? Maar het viruseiwit dat hij vond werd ook veel gebruikt in het lab dat de analyses deed. Dat zegt nog niks, maar je moet dan wel heel goed aantonen dat je werkelijk het oude eiwit meet.’ Een consortium aan onderzoekers onder wie Welker en Collins publiceerden daarom afgelopen jaar een richtlijn voor dit soort onderzoek. Daarnaast moet je alle ruwe data openbaar maken, vindt Collins.

Degradatiepatronen

Er is ook een chemische manier om oude van moderne eiwitten te scheiden, en Collins heeft zich daarin gespecialiseerd. Hij bestudeerde de kinetiek van alle modificaties die de eiwitten ondergaan, waaronder racemisatie en hydrolyse. Aan de hand daarvan kun je de ouderdom van een oud eiwit schatten, zoals Collins deed met drie miljoen jaar oude zeeschelpen. Tegelijker­tijd kun je vaststellen dat een eiwit dat die degradatie niet vertoont, mogelijk een vervuiling van een modern eiwit is. ‘Je kunt dus vaststellen dat je authentieke oude eiwitten meet, omdat ze de degradatiepatronen vertonen die je verwacht van oude samples.’

Tot slot kun je de lijn doortrekken. Collins: ‘Als dit de snelheid van verval is over de laatste miljoen jaar, dan is het onwaarschijnlijk dat we ooit een eiwitsequentie vinden uit de tijd van de dinosaurussen.’ Ook oude eiwitten hebben dus hun beperkingen, net als DNA. Het oudste eiwit tot nu toe gemeten is een 3,8 miljoen jaar oude eierschaal die Collins analyseerde. Het oudste geanalyseerde DNA is een paar honderdduizend jaar oud.

‘Het belangrijkste vraagstuk is nu hoe je zo veel mogelijk informatie uit een sample krijg’, zegt Collins. ‘De uitdaging is dan om niet alleen eiwit en DNA, maar ook lipiden en eventueel koolwaterstoffen te isoleren. Daaraan werken we momenteel.’