Via het totaalplaatje van stofwisselingsproducten wil TNO de productiecapaciteit van micro-organismen opvoeren. Metabolomics kan ook bruikbaar zijn voor het verbeteren van ketchup.

“Focussen op het bekende levert duidelijk niet genoeg op. Kijk naar bakkersgist. Het glycolyseproces ervan wordt al dertig jaar bestudeerd en bevat slechts tien reacties. Tot op de dag van vandaag bestaat daar geen deugdelijk model voor.” Aan het woord is Mariët van der Werf, productmanager Microbiële Productieprocessen van de businessunit Microbiologie bij het TNO kerngebied Kwaliteit van Leven. Ze vervolgt: “In de bioprocestechnologie past men stamverbetering toe om micro-organismen te verkrijgen met verhoogde productieniveaus van gewenste producten als vitaminen, enzymen en antibiotica. Door willekeurige mutagenese of gerichte genmodificatie worden knelpunten opgeheven die de productie in het proces remmen. De kunst is te beredeneren welk target voor dat doel te selecteren. De huidige selectiemethoden berusten nog te vaak op trial and error. Meer onderbuikgevoel dan een gedegen rationele keuze. Er is simpelweg te weinig bekend van deze micro-organismen.”

Die opvatting leeft niet alleen bij Van der Werf. In 2001 legde Roche Vitamins, nu onderdeel van DSM Nutritional Products, contact met TNO. Het bedrijf wilde gezamenlijk een methode ontwikkelen om de opbrengst van een metaboliet in een micro-organisme te verhogen (vanwege de geheimhoudingsplicht kan Van der Werf niet in detail treden). TNO wilde het probleem met een generieke technologie oplossen: toepasbaar op de bodembacterie in kwestie maar later ook bruikbaar voor andere (micro)organismen. Daarom viel de keuze op metabolomics. Van der Werf: “Bovendien staat het metaboloom op biochemisch niveau het dichtst bij het fenotype van een cel. Van eiwit, transcript naar gen neemt de relevantie voor de biologische functie sterk af.”

Het totaalplaatje van stofwisselingsproducten moest het antwoord geven waarom de ene stam meer product levert dan een andere. Het basisidee was simpel: meet de metabolomen, leg correlaties met statistiek, op basis daarvan ontstaat een gerangschikt lijstje met potentiële targets die je met moleculair genetische technieken of mediumoptimalisatie opvolgt.” Beide partijen waren gebaat bij samenwerking, aldus Van der Werf. “Roche vond het een te grote investering om de analysetechnieken voor metabolomics zelf in huis te halen terwijl wij via contractresearch de financiële middelen ontvingen om aan de techniekontwikkeling te werken.”

Aanzienlijke winst

William van Dongen, productmanager Analytical Sciences van TNO, typeert de ontwikkelde technologie graag als ‘een holistisch analyseplatform voor metabolomics’. “Het gaat om het meten van metabolieten via analytische technieken die ruimte bieden aan het meten van onverwachte componenten. Het is meten zonder vooroordeel, openstaan voor alles, niets uitsluiten.” Geschikte analysemethoden voor deze toepassing zijn gas- en vloeistofchromatografie (GC en LC) gekoppeld aan massaspectrometrie (MS). Gevoeligheid en snelheid zijn belangrijke meetparameters. Daarom worden zogenaamde niet-scannende MS-methoden gebruikt, zoals Time-Of-Flight, Fourier-Transform en Linear Ion Trap. Volgens Van Dongen beweegt TNO wereldwijd gezien aan het front van metabolomics. “TNO investeert al vijftien jaar in analyse­ technologieën die hiervoor nu inzetbaar zijn. Neem de vloeistofchromatografie gekoppeld met massaspectrometrie (LC-MS). Die is hier rond 1990 al ontwikkeld om niveaus van geneesmiddelen in humaan plasma te meten. Nu de laatste vijf jaar de MS-apparatuur flink aan gevoeligheid en snelheid wint, zijn bovendien aanzienlijk grotere aantallen metabolieten te meten met dezelfde analysemethode.” Met het ontwikkelde platform kan bijvoorbeeld 96 procent van het Bacillus subtilis metaboloom geanalyseerd worden.

Dit analytische platform in combinatie met biostatistische analyse is vervolgens toegepast om het microbiële productieproces te verbeteren. De resultaten toon toe te voegen, steeg de productie met tien procent. Van Dongen: “Op industriële schaal vertaalt zo’n toename zich naar aanzienlijke winst.”

Driehoeksverhouding

Metabolomics levert evenals andere genomics-technologieën immense hoeveelheden data op. Dat brengt een nieuwe uitdaging met zich mee: een zinvolle betekenis toekennen aan de verkregen informatie. “Het is de kunst het kaf van het koren te scheiden, aldus chemometrist Renger Jellema. “Er zijn veel bronnen die variatie veroorzaken. Maar wat is een echt verschil en wat is ruis?” Zijn werk begint niet pas wanneer de experimentele data al binnen zijn. “Bij de probleemaanpak werken we van meet af aan met de driehoeksverhouding tussen probleemeigenaar, analytisch platformbeheerder en data-analist. De gezamenlijke inzichten bepalen de uiteindelijke experimentele opzet.”

Door een complex metaboloom via GC- of LC-MS te scheiden, ontstaat een groot aantal overlappende pieken als gevolg van coëluerende metabolieten. Via een rekenkundige methode kunnen deze gescheiden worden. Jellema: “Dat heet deconvolutie van pieken. De krachtige rekenmethode die we binnen TNO hanteren is eigenlijk uit nood geboren. De commercieel beschikbare software is namelijk ongeschikt om op reproduceerbare wijze dergelijke grote hoeveelheden resultaten te verwerken. En dat laatste is uiteraard van groot belang als je concentraties van verschillende monsters wilt vergelijken.” De methode is gebaseerd op de zogenaamde multivariate data-analyse (MVDA), waarbij meerdere variabelen en de mate van samenhang tussen de verschillende variabelen onderzocht wordt. MVDA vormt ook de basis voor het filteren en rangschikken van de belangrijkste biomoleculen uit de datareeksen. Maar de standaard MVDA-tools als Principal Component Analysis en Partial Least Squares schieten daarin te kort, volgens Jellema. “Ze houden onvoldoende rekening met het experiment dat erachter zit. Daarom ontwikkelt TNO in samenwerking met de Universiteit van Amsterdam nieuwe methoden om zoveel mogelijk gegevens omhoog te halen uit functionele genomicsdatasets.”

Tomatenketchup

Een andere toepassing voor het analytisch platform in combinatie met multi-variate analyse ziet Van Dongen in quality chain modelling. Hij licht de term toe aan de hand van een voorbeeld. “Stel, je wilt tomatenketchup produceren waarbij kwaliteitsparameters als smaak en viscositeit volledig gelijk moeten blijven. Lastig wanneer je grondstof soms groene, dan weer overrijpe exemplaren bevat. Door via metabolomics de kritische parameters in het productieproces te selecteren ontstaat een focus op die variabelen die het eindresultaat bepalen. Het levert in tijd en productie enorme winst op als bekend is dat voor kwaliteitsbehoud alleen klep X een beetje open moet wanneer biomolecuul Y onder een bepaalde grenswaarde daalt.” Hij benadrukt dat deze toepassing nog in ontwikkeling is. “Het vergt vooral nogal wat van de multivariate data-analyse. Het is een technologiepush, een uitdagende exercitie waarin we nog wel wat partners kunnen gebruiken.” |

Van der Werf, MJ. Towards replacing closed with open target selection strategies.

Trends Biotechnol. 2005 Jan; 23(1):11-6

Van der Werf MJ, Jellema RH, Hankemeier T. Microbial metabolomics: replacing trial-and-error by the unbiased selection and ranking of targets. J Ind Microbiol Biotechnol. 2005 May 14 (elektronische voorpublicatie)

***Kader***

Feitelijk

Per 1 januari 2005 bestaat TNO uit vijf kerngebieden in plaats van uit vijftien instituten: Kwaliteit van Leven, Defensie en Veiligheid, Industrie en Techniek, Bouw en Ondergrond, en Informatie en Communicatietechnologie. Het voormalige TNO Voeding valt binnen ‘Kwaliteit van Leven’. (meer info: www.tno.nl/tno/index.xml)