‘Zodra een patiënt met een bacteriële infectie het ziekenhuis betreedt, wil de arts vooral weten met welk antibioticum hij die moet behandelen’, zegt Piet Cools, hoofdonderzoeker bij de vakgroep Diagnostische Wetenschappen van de Universiteit Gent. ‘De bacteriesoort zelf is minder relevant.’ Maar voordat bekend is welk antibioticum de infectie effectief te lijf kan gaan, zijn er soms wel drie dagen verstreken. Artsen gebruiken daarvoor namelijk een antibiogram om de juiste behandeling te bepalen. Dat is een betrouwbare methode waarmee je een bacterie-isolaat, een zuivere cultuur van een bacteriekolonie, blootstelt aan verschillende antibiotica om te zien welke daarvan de groei remmen.

Helaas is een antibiogram dus wel een langzame methode. Bovendien kijkt de arts slechts naar een beperkt aantal relevante antibiotica. ‘Daarom willen we toe naar een zelflerend systeem met gegevens van meerdere bacteriën en hun antibioticagevoeligheden, om zo vooraf te voorspellen wat de beste behandeling is voor de patiënt’, stelt Cools.

‘Het moet een zelflerend systeem worden met gegevens van meerdere bacteriën en hun antibioticagevoeligheden’

Piet Cools

Om te weten met welke bacterie een patiënt geïnfecteerd is, gebruiken diagnostische laboratoria de ionisatietechniek Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation (MALDI) in combinatie met massascheiding op basis van Time-of-Flight massaspectrometrie (TOF-MS). Deze methode maakt onderscheid in massa van bacteriële peptides op basis van de snelheid die ze, in de vorm van ionen, afleggen naar een detector. Het uitgangssignaal is een massaspectrum dat uniek is voor elke bacteriesoort. De pieken in de massaspectra geven de hoeveelheid van de aanwezige peptides aan, waarvan alleen de hoge pieken doorgaans in de databanken terechtkomen als ‘vingerafdruk’ voor elke bacteriesoort.

De andere peptides, die in lagere concentraties aanwezig zijn, laat men weg uit de spectra na identificatie met MALDI-TOF. Een gemiste kans, vindt Nick Versmessen, promovendus in de groep van Cools. ‘Het innovatieve van ons project is, dat we ook deze kleine pieken proberen mee te nemen om meer verschillen te ontdekken in de eiwitpatronen. We komen dan op het niveau van bacteriestammen, dat zijn subtypes binnen een bacteriesoort. Zo hebben we de complete informatie van elke bacteriesoort om te analyseren en uiteindelijk tot een goed algoritme te komen dat antibioticaresistentie voorspelt.’

Genomic sequencing

De eiwitpatronen alleen zullen niet genoeg zijn om antibioticaresistentie te voorspellen. Versmessen: ‘We gaan niet alle patronen terugvinden in de massaspectra, omdat sommige resistentiegenen simpelweg niet aan staan en er dus geen eiwit van aanwezig is in de bacterie op het moment van MALDI-TOF. Die genen komen pas in transcriptie op het moment van blootstelling aan bepaalde antibiotica. Verder kunnen ook suikerketens en lipiden een rol spelen in resistentiemechanismes. Vandaar dat we dus ook genomic sequencing meenemen om de bijbehorende resistentiegenen te achterhalen. De eiwitpatronen moeten we achteraf met MALDI-TOF verkrijgen na blootstelling aan de betreffende antibiotica.’

Versmessen werkt aan een proof-of-concept met vijftig bacteriestammen van E. coli waarvan hij inmiddels het totale genoom in kaart heeft gebracht. Een volgende stap is het zoeken naar resistentiegenen via markers in de DNA-sequenties. ‘Er was nog geen protocol voor het in kaart brengen en analyseren van zo’n groot aantal genomen’, vertelt hij. ‘In samenwerking met de Hogeschool West-Vlaanderen hebben we daarom een protocol ontwikkeld voor de sequencetechniek Oxford Nanopore Sequencing. De genetische informatie gaan we met genomic assembly ordenen tot clusters. Dat doen we met de bioinformatica tool Flye om zo beter op zoek te gaan naar de resistentiegenen.’

In het lab controleert Versmessen met antibiogrammen vervolgens de antibioticagevoeligheid. ‘Met de bacteriën op kweek, blootgesteld aan zestien antibiotica, weet ik de antibioticagevoeligheid van elke stam. Een eerste resultaat is dat die gevoeligheid in de meeste gevallen, ongeveer 90%, overeenkomt met de gevonden resistentiegenen.’

Enorme berg data

Versmessen krijgt enorme hoeveelheden data te verwerken. ‘Die duizenden bestanden kun je niet manueel verwerken. Daar biedt de bioinformatica en machine learning uitkomst. We ontwikkelen een bioinformaticapijplijn in samenwerking met de Hogeschool West-Vlaanderen.’

Van algoritmes ontwikkelen op basis van massaspectra weet Sven Degroeve, hoogleraar machine learning aan de Universiteit Gent en staff scientist bij het VIB, alles af. Hij werkt op dit onderwerp samen met de groep van Cools. ‘We willen zo snel mogelijk van de massaspectra naar het resistentiepatroon. De gelijkenis tussen eiwitpatronen is belangrijk om een databank aan te kunnen leggen van bacteriestammen. Met clusters op genetische eigenschappen kunnen we een ordening aanbrengen op bacteriestamniveau.’

‘We willen zo snel mogelijk van de massaspectra naar het resistentiepatroon’

Sven Degroeve

Het uiteindelijke doel is dus om op basis van de MALDI-TOF-spectra het te verwachten resistentiepatroon te voorspellen. Degroeve: ‘We zullen hiervoor twee benaderingen volgen. De eerste is op het niveau van unsupervised learning. Zodra we een robuuste en reproduceerbare metriek hebben gevonden om het verschil tussen twee spectra te bepalen, kunnen we verder. Spectra clusteren we zo dat bacteriën die tot dezelfde stam behoren in hetzelfde cluster terechtkomen. Voor elk cluster bepalen we dan het resistentiepatroon.

Bij een nieuw geanalyseerd massaspectrum dat binnen een van deze clusters valt, weten we welke bijbehorende antibiotica we toe moeten dienen. Maar, als we een spectrum tegenkomen dat ver weg ligt van de bekende clusters in ons model, hebben we te maken met een nieuwe bacteriestam. We gaan dan in een tweede benadering een zogenoemd supervised leeralgoritme inzetten om de computer het resistentiepatroon te leren voorspellen, rechtstreeks vanuit het spectrum. Dit noemen we ‘supervised’ omdat het leert aan de hand van MALDI-TOF-spectra die reeds experimenteel zijn gekoppeld aan een resistentiepatroon.’

Om dit mogelijk te maken is de reproduceerbaarheid van data heel belangrijk. ‘We moeten dus heel vaak metingen herhalen en een enorme dataset aanleggen.’

De verwachting is dat het voorspellend antibioticaresistentiemodel pas na twee jaar gereed zal zijn, maar het moet al wel in de praktijk getest zijn. Cools: ‘The proof of the pudding is in the eating. We moeten het model dus eerst in de praktijk gaan testen. Zodra een patiënt met een bacteriële infectie op bijvoorbeeld de spoedafdeling binnenkomt, zetten we de bacterie op kweek en kijken we na MALDI-TOF en sequencing om welke stam het gaat in ons model. Vervolgens gaan we de antibioticagevoeligheid na op basis van het genetische cluster waartoe de bacterie behoort. De arts behandelt de patiënt nog steeds volgens de uitslag van het antibiogram, maar ondertussen weten wij al of de behandeling aanslaat of niet. Deze procedure wordt heel vaak herhaald, net zolang tot het model zo betrouwbaar is dat het de praktijk in kan.’

Degroeve voegt toe: ‘Eerst moeten we vertrouwen krijgen met de machine learning en het parallel toepassen naast de normale workflow. Het zou mooi zijn als het gebruik standaard wordt en ook andere labo’s dit systeem gaan maken.’

Direct een behandelplan

Naast het voorspellen van de antibioticaresistentie, is een ander doel van het model het snel ingrijpen bij een uitbraak. Cools: ‘Stel bijvoorbeeld dat er een pasgeboren baby met een superresistente Pseudomonas-infectie in het ziekenhuis ligt. Als een paar dagen later de arts opnieuw een patiënt ontdekt met dezelfde ernstige bacteriële infectie, gaan alle alarmbellen af. De vraag is dan of het toevallig om dezelfde bacterie gaat of dat het een kloon is, ofwel dat de oorspronkelijke bacterie zich verspreid heeft door contaminatie of via de lucht. In het laatste geval moet het personeel direct de patiënt behandelen en afdelingen sluiten voor verdere contaminatie.’ Het model geeft dan direct een behandelplan, in tegenstelling tot een complete genoomanalyse: dat neemt namelijk te veel tijd in beslag.

Doordat antibioticaresistentie alsmaar toeneemt, is het model een welkome aanwinst. ‘En als dit werkt in het UZ Gent, zal het in elk ziekenhuis werken’, besluit Cools.