Gram-kleuring van bacteriën werkt anders dan iedereen altijd dacht. En achteraf heeft de uitvinder een bijzonder gelukkige hand gehad bij het kiezen van de kleurstof, suggereert een publicatie in ACS Chemical Biology.

Die kleuring, in 1884 ontwikkeld door de Deense bacterioloog Hans Christian Gram, maakt onderscheid tussen ‘Gram-negatieve’ bacteriën, die twee celmembranen hebben met een dun laagje peptidoglycaan er tussen, en ‘Gram-positieve’, die maar één membraan hebben met een veel dikkere laag peptidoglycaan aan de buitenkant. Van beide constructies bestaan talloze uitvoeringen, maar in situaties waar je maar een paar bacteriesoorten uit elkaar hoeft te houden is de test uiterst handig.

Als kleurstof dient methylviolet 10B, ook bekend als kristalviolet, in combinatie met lugol, een oplossing van jodium en kaliumjodide. Deze behandeling kleurt alle bacteriën paars, maar bij Gram-negatieve kun je die kleur er met alcohol weer uit wassen. Vervolgens maak je ze desgewenst weer zichtbaar met een andere kleurstof, bijvoorbeeld fuchsine dat ze roze kleurt.

Tot nu toe werd aangenomen dat het kristalviolet dwars door alle membranen trekt en zich ophoopt in het cytoplasma. Bij Gram-positieve bacteriën zou vervolgens de dikke laag peptidoglycaan, die ook nog wordt verdicht door reacties met het lugol, voorkomen dat de alcohol de kleur er weer uit krijgt.

Het nieuwe onderzoek suggereert echter dat het kristalviolet helemaal niet door het binnenste membraan heen kan en al die tijd in het peptidoglycaan blijft hangen. Bij Gram-negatieve bacteriën past daar om te beginnen al weinig kleurstof in, en met een beetje alcohol is dat er snel uit. Bij Gram-positieve bacteriën hoopt zich veel meer kleurstof op; waarschijnlijk krijgt de alcohol dat uiteindelijk ook wel weg maar niet binnen de korte tijd die het kleuringsprotocol er voor reserveert.

Onderzoekers van Temple University in Philadelphia komen tot die conclusie op basis van geavanceerde lichtverstrooiingsmetingen aan E.coli, een Gram-negatieve soort. Als je die behandelt met kristalviolet zie je de kleuring eerst pieken omdat de kleurstof zich aan het buitenmembraan hecht, dan een dip in het signaal als de moleculen er door zijn en door de peptidoglycaanlaag bewegen. Daarna komt er een tweede piek als ze zich ophopen op het binnenmembraan, maar daarna gebeurt er niets meer.

Herhaal je de proef met malachietgroen, een kleurstof waarvan wél vaststaat dat hij het cytoplasma kan bereiken, dan zie je dat wel degelijk gebeuren in de vorm van een tweede dip. Formeel bewijst het niets, zeker niet zolang het niet wordt bevestigd bij een aantal andere bacteriesoorten, maar het doet des te meer vermoeden.

Onbekend is hoe veel kleurstoffen de heer Gram indertijd heeft uitgeprobeerd, maar hij heeft kennelijk wel een slimme keus gedaan. De volgende stap is om de nieuw verworven kennis te verwerken in nieuwe kleuringsmethoden die wat meer onderscheid tussen verschillende bacteriesoorten maken.

bron: C&EN