Met de nieuwe imaging-techniek SunTag kun je eiwitten dusdanig fel labelen, dat je ze individueel kunt volgen in levende cellen.

Huidige visualisatietechnieken maken momentopnames in grote aantallen cellen. Dat doe je door een fluorescent eiwit zoals GFP (green fluorescent protein) te binden aan het eiwit dat je bestudeert. Je kunt daarbij alleen niet zien wat er tijdens de translatie (vertaling van gen naar eiwit) is gebeurd, omdat het GFP-eiwit op dat moment nog in de maak was.

De nieuwe imaging-techniek SunTag neemt een slimme omweg. ‘Het assay bindt GFP niet rechtstreeks aan het te bestuderen eiwit, maar doet dat via kleine SunTag-peptides. Aan zo’n peptide bindt een anti­lichaam en daaraan zit dan het fluorescente eiwit’, legt Tim Hoek uit. Samen met Deepak Khuperkar leidt hij het SunTag-project. Ze maken onderdeel uit van de Tanenbaum-onderzoeksgroep, gevestigd aan het Hubrecht Instituut in Utrecht.

RNA-trucs in beeld

De nieuwste SunTag-truc is visualisatie van nonsense-mediated mRNA decay (NMD). Dit bewakingsmechanisme controleert de kwaliteit van mRNA-moleculen en maakt ze waar nodig onklaar. Om precies te zijn zoekt NMD naar vroegtijdige stopcodons (PTCs) in het mRNA die ontstaan door puntmutaties in het DNA. Eiwitten die ondanks zo’n nonsense mutatie toch worden gemaakt zijn incompleet en meestal niet functioneel. Onder meer de ziekte van Duchenne en taaislijmziekte kunnen op deze manier ontstaan.

SunTag leent zich uitstekend voor de visualisatie van dit proces, omdat NMD op een heel kort moment gebeurt, aldus Hoek. ‘Het defecte RNA-molecuul blijft een poosje bestaan, maar precies als de translatie begint wordt het afgebroken. Met SunTag kun je zowel de translatie als de afbraak zien.’

‘Je kunt zowel de translatie als de afbraak zien’

Het werkt als volgt: je introduceert een artificieel stuk DNA in de cel, waarvan het zogenoemde reporter-mRNA ten eerste codeert voor een serie SunTag-peptides. Als die uit het ribosoom zijn gekomen, binden de antilichamen aan die peptides. Aan de antilichamen zitten GFP’s en die lichten het te bestuderen eiwit-in-wording groen op. Ten tweede bevat het reporter-mRNA een groep bindingsplaatsen die áchter het gemuteerde stopcodon zitten en die rood oplichten. Als NMD nog niet is geïnduceerd, zitten de groene en rode markers nog met elkaar in hetzelfde complex. ‘Je ziet dat de stipjes minutenlang met elkaar meebewegen en dan opeens uit elkaar gaan. Op dat moment is het mRNA geknipt bij het PTC dankzij NMD-inductie’, vertelt Hoek.

Dynamiek

Als je SunTag gebruikt, zie je moleculen veel feller oplichten dan normaal. Hoek: ‘De SunTag-peptides zijn veel kleiner dan GFP zelf. Meestal zitten er 24 peptides in het te bestuderen eiwit. Daardoor kun je veel meer GFPs binden en krijg je dus een heel sterk signaal.’ Dankzij die truc kunnen de onderzoekers de kinetiek van allerlei processen meten. Eerdere studies zijn het bijvoorbeeld niet eens over de vraag of NMD vooral in de eerste translatieronde wordt geïnduceerd, of dat dit elke ronde kan gebeuren. Nu blijkt dat elk ribosoom een kans heeft om NMD in gang te zetten.

‘Dankzij het project weten we meer over de dynamiek van translatie, mRNA-stabiliteit en NMD’, zegt Hoek. ‘Onze kennis over genexpressie heeft die nuance nodig om het begrip over processen en ziektes uit te breiden. Wat we nu weten dankzij SunTag is nog maar het topje van de ijsberg, want aan de regulatie van translatie valt nog ontzettend veel te ontdekken.’