Een niet-natuurlijk aminozuur doet het beter dan een losse homogene katalysator.

Natuurlijke eiwitten kun je verbouwen tot katalysator voor niet-biologische reacties door op een strategische plek een aminozuur te vervangen door een onnatuurlijke variant met een reactieve zijketen. Bijvoorbeeld gemodificeerd fenylalanine dat voor aniline speelt, schrijven Gerard Roelfes en collega’s van de Rijksuniversiteit Groningen in Nature Chemistry. Met zulke designer-enzymen denken ze het arsenaal van de chemische synthese te kunnen uitbreiden, en productieprocessen duurzamer te kunnen maken.

In de publicatie stelt de groep dat de natuur soms ook dergelijke trucs uithaalt. De twintig canonieke aminozuren bieden een beperkte keuze aan functionele zijketens, en dus vertrouwen sommige enzymen voor hun functionaliteit op posttranslationele modificaties van de aminozuren rond hun actieve centrum. Maar het idee om zoiets te doen bij designer-enzymen is volgens de Groningers nog amper onderzocht. Er zijn al vaak genoeg niet-natuurlijke aminozuren ingebouwd in eiwitten, maar zelden op de actieve plek. En als ze daar zitten, is het doorgaans alleen om de positionering van de om te zetten moleculen te verbeteren; bij de eigenlijke katalytische reactie zijn ze niet betrokken. De Groningers hebben dat laatste nu uitgeprobeerd met het niet-natuurlijke aminozuur p-aminofenylalanine (pAF).

Aniline

De functionele groep van pAF komt overeen met aminobenzeen, oftewel aniline, een klassieke grondstof voor kleurstoffen. Losse anilinemoleculen werken als nucleofiele katalysator en bevorderen met name de vorming van hydrazonen (R₁R₂C=NNHR₃) en oximes (R₁R₂C=NOR₃). Een van de grondstoffen is daarbij een aldehyde dat met de anilinegroep tijdelijk een iminiumion vormt en zo wordt geactiveerd. Echt efficiënt werkt dit echter niet.

Het pAF werd ingebouwd in LmrR, een transcriptiefactor uit de bacterie Lactococcus lactis. LmrR vormt donutvormige dimeren met een centrale holte, die een breed spectrum aan hydrofobe moleculen kan adsorberen. Een viertal aminozuren rond die promiscue holte komt in aanmerking voor vervanging door pAF, en Roelfes en collega’s hebben alle vier de mogelijkheden uitgeprobeerd. In de praktijk werkt ook hier een posttranslationele modificatie het meest efficiënt: je bouwt p-azidofenylalanine in dat je achteraf reduceert.

550 keer sneller door synergie van twee effecten

Alle varianten blijken katalytisch actief, maar LmrR_V15pAF, waarbij pAF een valine op positie 15 vervangt, presteert verreweg het best. Als modelreactie namen de Groningers de koppeling van 4-hydrazino-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazool (NBD-H) en 4-hydroxybenzaldehyde (4-HBA) tot een hydrazon, een keuze die volgens Roelfes mede is ingegeven omdat het een verkleuring geeft die je makkelijk kunt volgen. De reactiesnelheidsconstante blijkt minstens 550 keer hoger dan wanneer je losse anilinemoleculen gebruikt.

Voor oximes kun je die vergelijking niet eens maken. Aniline katalyseert de vorming wel, maar reageert direct daarna door met het gevormde oxime tot een ongewenst eindproduct. LmrR_V15pAF heeft daar geen last van.

Synergie

Roelfes schrijft de toename van de reactiesnelheid toe aan de synergie van twee effecten. De binding met het enzym versterkt de reactiviteit van de anilinegroep. Maar net zo belangrijk is dat de holte van het enzym de reactanten bij elkaar brengt, zodat je ter plekke een hogere effectieve concentratie krijgt dan in de rest van de oplossing. Vervang je pAF door een inactief tyrosine, dan zie je ook een katalytische werking. Alleen is hij een factor tien lager, en door de actieve plek verder te optimaliseren is dat verschil ongetwijfeld nog te vergroten. Het combineren van deze twee strategieën ziet Roelfes als een goed uitgangspunt voor verdere optimalisatie van de rol van niet-natuurlijke aminozuren in de katalyse.