In Groningen is het effect van vrijwel alle mogelijke mutaties in een enzym in kaart gebracht. Zo kun je zien waar je moet beginnen als je de werking van zo’n enzym wilt wijzigen, schrijven Gerrit Poelarends en collega’s in Nature Communications.

Om te beginnen heeft het een twintig keer hogere capaciteit opgeleverd, en een voorkeur voor het stereo-isomeer dat er eerst juist niet uit kwam.

Het enym heet 4-OT, wat staat voor 4-oxalocrotonaat tautomerase. Het komt voor in de bacterie Pseudomonas putida, waar het 2-hydroxymuconaat omzet in 2-oxohex-3-enedioaat. Het bestaat uit zes identieke subunits die elk slechts 62 aminozuurbouwstenen tellen, en de werking heeft alles te maken met een prolinebouwsteen op plaats één, dus aan het N-uiteinde van de eiwitketen.

Poelarends zocht een katalysator voor een zogeheten Michael-additie, waarbij je aceetaldehyde (ethanal) koppelt aan een nitroalkeen. Dat levert een gamma-nitroaldehyde op dat je weer kunt omzetten in een derivaat van gamma-aminoboterzuur (GABA). En zulke GABA-derivaten blijken vaak waardevolle geneesmiddelen, die tot nu toe via een heel andere route worden gesynthetiseerd omdat het via zo’n Michael-additie niet lukt.

Recent is ontdekt dat het wél lukt met ‘losse’ prolinemoleculen als organische katalysator, maar lang niet efficiënt genoeg en alleen in onaangename organische oplosmiddelen. Vandaar Poelarends’ idee om het met de proline in 4-OT te proberen.

Inderdaad bleek 4-OT Michael-addities te kunnen katalyseren tussen aceetaldehyde of butanal enerzijds en een hele reeks nitroalkenen anderzijds. Maar het natuurlijke enzym is veel te langzaam, en als het al een voorkeur heeft voor een van beide mogelijke stereo-isomeren, dan is het vaak net de verkeerde.

Waarop Poelarends besloot in kaart te brengen wat er gebeurt als je één aminozuur vervangt door een van de 19 andere natuurlijke aminozuren, en dat voor alle aminozuren in de keten op dat ene proline na. Dat zijn dus 61 maal 19 varianten. Om ze te maken werden de bijbehorende DNA-sequenties stuk voor stuk aangemaakt door een gespecialiseerd bedrijf, waarna ze elk in hun eigen E.coli-kweekje werden gemonteerd.

Het leverde verschillende ‘kaarten’ op: een die aangeeft in hoeverre het kweekje er überhaupt in slaagt om een in water oplosbaar enzym te produceren, een reeks die de katalytische activiteit van het enzym aangeven wanneer je het ‘voert’ met verschillende combinaties van grondstoffen, en een serie die aangeeft welke stereo-isomeren er uit komen. Elke kaart vertoont een reeks ‘hot spots’: wijzigingen die duidelijk meer invloed hebben dan gemiddeld, in positieve of negatieve zin.

De volgende stap is om meerdere bouwstenen tegelijk te gaan vervangen, en daarvoor kies je om te beginnen de aminozuren die op de verschillende kaarten opdoken als ‘hot spots’ met positief effect.

Het nu gepresenteerde ‘verbeterde’ enzym bevat twee van die mutaties. Met de aantekening dat Poelarends c.s. eigenlijk niet begrijpen waarom deze nu ineens zo veel beter werkt - een duidelijke theoretische verklaring ontbreekt.

Een enzym ontwikkelen dat nog veel beter werkt, lijkt dus een kwestie van nog meer veelbelovende combinaties uitproberen.

bron: RUG, Nature Communications