Zaai cellen in een gel en ze gaan zich bijna spontaan organiseren en differentiëren tot mini-orgaantjes. Die 3D-kweektechniek is inmiddels grotendeels geautomatiseerd en dat moet het succes van geneesmiddelenontwikkeling gaan bevorderen.

‘Als je cellen kweekt in een dunne laag op een plastic ondergrond, dan zien ze er onder de microscoop uit als fried eggs’, zegt Leo Price, oprichter en ceo van OcellO, een Leids biotechbedrijf dat sinds 2011 weefselkweek en analyse­technologie ontwikkelt en gebruikt om nieuwe geneesmiddelen te testen voor farmaceutische bedrijven. ‘Platte cellen lijken niet op echt weefsel, maar van oudsher gebeurt veel celkweek toch in 2D. Wij richten ons op de vraag hoe je realistische menselijke weefsels kunt kweken.’

Decennia geleden is al aanvang gemaakt om celgroei te stimuleren in drie dimensies, in eiwitrijke hydrogels, aldus Price, die zelf al jaren onderzoek doet naar die techniek. Zulke hydrogels hebben wat weg van gelatine en zitten vol extracellulaire matrixeiwitten. Ze leveren ook allerlei mechanische prikkels, zoals een zekere stijfheid, die cellen doet denken aan hun natuurlijke biotoop.

 

Gedifferentieerd weefsel

Volgens Price groeien cellen in een hydrogel uit tot bolletjes met behoorlijk wat structuren, zoals buizen en holtes. Er ontstaat zelforganisatie en differentiatie door contact met de gel en buurcellen. ‘De omgeving bepaalt dus de morfologie van het weefsel, en vervolgens de functie, want melkklierepitheel gaat melkeiwitten afscheiden, en nierbuisjes gaan zout en water pompen. Vorm en functie gaan hand in hand.’

Driedimensionale kweek voorkomt ook verlies van allerlei eigenschappen, bijvoorbeeld bij tumorweefsel. Price: ‘Als je cellen van een stukje tumor in Petrischalen kweekt, sterft 99,9 %. Een of twee cellen doen het wel en die gaan delen. Door de selectiedruk van de kweekmethode krijg je een unieke kloon. Dat is op zich wel een bruikbaar model, maar het is niet representatief voor wat er allemaal gebeurt in de oorspronkelijke tumor.’ Door tumorcellen in hydrogels te kweken, overleven veel meer cellen en ontstaat gedifferentieerd weefsel dat beter overeenkomt met de oorspronkelijke tumor. Het idee is dat screening met anti-tumormiddelen resultaten opleveren die meer lijken op een test in een patiënt.

OcellO gebruikt diverse bronnen – menselijk weefsel, cellijnen, tumoren – voor driedimensionale kweektechnologie. Sinds een aantal jaar zitten ook organoïden in het arsenaal. Die kweekmethode gebruikt geoctrooieerde stamceltechnologie, kweekmedium en groeifactoren om mini-orgaantjes te laten groeien tot maximaal enkele millimeters in doorsnede. Hubrecht Organoid Technology (HUB), een stichting van het Hubrecht Lab die voortkomt uit onderzoek van de groep van Hans Clevers (zie interview via deze link), licenseert de techniek uit.

 

Op grote schaal

De screeningstechnologie van OcellO maakt het mogelijk om grote aantallen weefsels of organoïden tegelijkertijd te kweken in een 384-wells-plaat. Screening met stoffen of antilichamen is grotendeels geautomatiseerd met microscopen en beeld­analysesoftware. Algoritmes scoren per welletje honderden eigenschappen: organoïdaantallen, celaantallen per organoïd, volumes, morfologie, of vorm van de celkern bijvoorbeeld. De computer onderscheidt vervolgens toevallige variatie van relevante verschillen.

 

‘Weefselkweek is niet representatief voor wat er gebeurt in de oorspronkelijke tumor’

Price: ‘In het verleden staarden mensen door een microscoop om eigenschappen te scoren. Maar hoe complexer het weefsel, hoe meer je moet meten. In één experiment kunnen we miljoenen organoïden of andere weefsels groeien en analyseren. We hebben zelfs machine learning gebruikt om de computer te laten bepalen op welke eigenschappen je moet letten om het effect van een geneesmiddel te meten. Door honderden verschillende celeigenschappen te meten, kun je ook eerder bijwerkingen op het spoor komen. Je signaleert makkelijker ongewenste bijeffecten of toxiciteit.’

‘De bedoeling is dat driedimensionale kweek van menselijke weefsels de middenpositie gaat innemen tussen dierproeven en klinische trials’, zegt Jos Joore, ceo van Mimetas in Leiden, een bedrijf dat weefsels kweekt en analyseert op een ‘Organoplate’. Joore: ‘Je werkt met menselijke weefsels in drie dimensies, en door automatisering is het steeds makkelijker om op grote schaal experimenten te doen en resultaten uit te lezen. Het idee is dat het betere voorspellingen gaat geven. Het grote probleem van farma is dat 90 % van de stoffen die je selecteert in preklinisch onderzoek faalt in klinische trials.’

In de kweekplaat van Mimetas lopen parallelle kanaaltjes. Cellen zaai je in een gel in een van die kanaaltjes, terwijl kweekvloeistof door een parallel kanaaltje stroomt. Je kunt cellen ook stimuleren om uit te groeien tot een buisje, zoals een bloedvat, niertubulus of darmepitheel. Tevens zijn combinaties mogelijk, zoals een reepje hersenweefsel met een bloedvat ernaast.

 

Rijpen

Begin dit jaar publiceerde een aantal medewerkers van Mimetas met de groep van Hans Clevers in Nature Biotechnology over de kweek van nierorganoïden. Menselijke nierorganoïden groeiden daarin op een OrganoPlate tot lekdichte tubuli. Zo’n model kun je gebruiken om stoffen te screenen, bijvoorbeeld op toxiciteit voor nierweefsel.

Mimetas verkoopt kweekplaten, maar volgens Joore willen steeds meer klanten liever dat het bedrijf ook het assay ontwikkelt. ‘Het hele idee is dat wij combinatie maken van een driedimensionaal kweekplatform samen met organoïdtechnologie, zodat je bijvoorbeeld een hanteerbaar darmmodel aan een klant kunt leveren, waarmee het lab twee dagen later aan de slag kan in een screening’, zegt Joore.

Weefsels op zo’n kweekplaat inrichten en laten uitgroeien, kost - afhankelijk van de celbiologie – enkele dagen tot weken. Joore: ‘Darmmodelletjes en bloedvaten zijn in een dag of vier vijf goed om assays op te doen. Andere cellen delen langzamer of hebben meer tijd nodig om te rijpen. Bij levercellen duurt het bijvoorbeeld wat langer. We doen ook differentiatie van zenuwcellen, en dat kan zelfs twee tot drie maanden duren voor specifieke neuronen. Biologie heeft zijn eigen tempo, en dat vertaalt zich in andere tijdslijnen per weefsel.’

 

‘Hoe complexer het weefsel, hoe meer je moet meten’

Het gebruik van menselijk weefsel voor dit soort onderzoek is aan allerlei regels gebonden. ‘Dat verschilt van weefsel tot weefsel, niet alle cellen mag je bijvoorbeeld voor commerciële doelen gebruiken’, zegt Joore. Aan de andere kant is menselijk weefsel te koop, waarbij de toestemming is geregeld. Daaruit kunnen labs eigen cellijnen en organoïden kweken.

 

Validatie

De technologie van weefselkweek en drug screening in driedimensionale systemen is relatief nieuw, en veel standaardprotocollen zijn gebaseerd op ‘platte’ celkweek en dierproeven. Dat leidt al snel tot vragen over validatie ten opzichte van oude testmethodes. Joore: ‘Dat zien we vooral bij toxicologische modellen. Bij de ontwikkeling van ziektemodellen is het eenvoudiger om mensen te overtuigen. Wij hebben een test ontwikkeld waarin je kunt laten zien of afweercellen een tumor opzoeken en aanvallen. Je kunt daarmee stoffen testen die dat celgedrag beïnvloeden. Als je in een filmpje kunt tonen dat immuuncellen door de bloedvatwand heen naar de tumor bewegen, dan zijn er geen vragen meer over de waarde van het model.’

Een van de mooie kanten van deze kweektechnologie is dat je drug screening kunt doen op weefsels van tientallen verschillende personen tegelijk, aldus Joore. ‘Dus van mensen met verschillende raciale achtergronden, of met verschillend geslacht, leeftijd en leefstijl. Dan kun je proeven doen op een populatie die representatiever is dan één cellijn. Dan zie je waarschijnlijk veel eerder of verschillende patiënten anders gaan reageren op een nieuw middel. De belofte van stamceltechnieken, organoïden en weefsels-on-a-chip is dat je daarmee tests kunt maken die beter voorspellen, zodat in een later stadium van geneesmiddelenontwikkeling veel minder stoffen alsnog afvallen.’