Wat gebeurt er allemaal onderhuids in ons lichaam? Hoe verspreiden kankercellen zich bijvoorbeeld? En verdwijnen die ook echt allemaal na gebruik van medicijnen? Met Bioluminescentie Imaging (BLI) is het mogelijk om zulke processen zichtbaar te maken in levende muizen. En in de toekomst misschien ook in ons eigen lichaam.

Dankzij het enzym luciferase kunnen glimwormen en vuurvliegjes lichtsignalen uitzenden waarmee ze elkaar in het donker kunnen vinden. Dit licht is zo sterk dat je er zelfs een krant bij kunt lezen, tenminste als het diertje netjes van links naar rechts over de regels kruipt. Deze bioluminescentie ontstaat door een omzetting van luciferine met zuurstof tot oxyluciferine. Al jaren geleden bedachten wetenschappers dat dit proces niet alleen handig is voor deze diertjes zelf, maar ook voor moleculair biologisch onderzoek. Vandaar dat luciferase vaak wordt toegepast als reportereiwit. Dat betekent dat de genetische code voor dit enzym wordt gekoppeld aan de aan/uit-schakelaar van een ander gen dat codeert voor een bepaald eiwit, waarvan men wil weten waar en hoe dit eiwit tot expressie komt binnen een cel of weefsel. Door de ontwikkeling van zeer gevoelige camera’s is het nu niet alleen mogelijk om dit te bekijken in losse cellen en weefsels, maar ook in levende dieren. Zo is de techniek Bioluminescentie Imaging (BLI) geboren.

Clemens Löwik, onderzoeker aan het Leids Universitair Medisch Centrum, heeft zich de afgelopen jaren ontwikkeld tot expert op het gebied van deze techniek. Daarvoor werd hij vorig jaar, met samenwerkende onderzoekers uit Milaan en Londen, zelfs genomineerd voor de Descartes wetenschapsprijs van de Europese Commissie. Een gesprek met hem maakt al snel duidelijk dat bioluminescentie een techniek is met enorme mogelijkheden.

 

Transgeen

Bioluminescentie kan gebruikt worden om biologische processen zichtbaar te maken in levende muizen, bijvoorbeeld om te onderzoeken wat de functie is van een specifiek gen. Daarvoor creëert Löwik een transgene muis, waarbij de genetische code van luciferase direct achter de aan/uit-schakelaar (de promoter) van het te bestuderen gen is gezet. Er is dus een extra reportergen ingebracht die dezelfde aan/uit-schakelaar heeft als het te onderzoeken gen. Hierdoor wordt elke keer als de schakelaar van het te bestuderen gen wordt aangezet , ook een luciferase molecuul gevormd op exact dezelfde plaats als waar het te bestuderen gen tot expressie komt. Luciferase laat zo dus precies zien waar en wanneer dit gen tot expressie komt. Löwik en zijn collega’s hebben deze methode onder meer gebruikt voor hun onderzoek naar botvorming. Door gebruik te maken van verschillende reportereiwitten is het zelfs mogelijk om meerdere genen tegelijkertijd te volgen.

Om de luciferaseactiviteit in de muis te kunnen bekijken, wordt de muis onder narcose gebracht en ingespoten met het substraat luciferine. Na enkele minuten heeft de luciferine zich al verspreid over het gehele lichaam en zal afhankelijk van de hoeveelheid aanwezige luciferase-expressie een bepaalde hoeveelheid rood licht worden gegenereerd. De muis kan nu onder de camera gelegd worden. Het uitgezonden rode licht heeft de gunstige eigenschap dat het goed door lichaamsweefsel heen gaat, tot een diepte van wel twee centimeter. De gebruikte camera is zo gevoelig dat het bijna een enkel lichtfoton kan detecteren. Met speciale software wordt de hoeveelheid fotonen omgezet in een zichtbaar kleurenbeeld, waarbij iedere kleur een bepaalde lichtintensiteit weergeeft. Hieruit is af te leiden van hoeveel cellen dit licht afkomstig was. Volgens Löwik is met deze techniek een cluster van honderd cellen met luciferase al goed zien.

Christopher Contag van de Stanford Universiteit (VS), de grondlegger van BLI, liet onlangs zien dat hij met de nieuwste camera zelfs één tot tien cellen kan detecteren, zo vertelde hij in september tijdens het congres van de Society of Molecular Imaging. Dat is nogal een verschil met de meer bekende imaging technieken, zoals MRI en PET-scanning, waarbij je alleen clusters van meer dan honderdduizend cellen zichtbaar kunt maken. Alleen is het nog moeilijk om bij BLI precies ruimtelijk aan te geven waar deze cellen zich bevinden, doordat alleen nog maar in twee dimensies gekeken kan worden. Met een recent gekregen prototype van een driedimensionale camera, hoopt Löwik deze ruimtelijke resolutie wel te verbeteren.

 

Uitzaaiingen

Bioluminescentie is niet alleen bruikbaar voor het volgen van genexpressie, maar ook voor het volgen van bijvoorbeeld tumorcellen. Om dat te kunnen doen, verandert de onderzoeksgroep van Löwik de tumorcellen zo dat ze continu luciferase aanmaken. Daarna worden deze bij muizen ingespoten om te zien waar deze cellen naartoe bewegen en verder groeien. Bij deze muizen is dan wel het afweersysteem uitgeschakeld om te voorkomen dat deze cellen direct worden afgestoten.

De groep van Löwik gebruikt deze muizen voor onderzoek naar uitzaaiingen van borst- en prostaatkanker, die vooral voorkomen in het skelet. Grotere uitzaaiingen kunnen zorgen voor afbraak van het skelet, zoals te zien is op röntgenfoto’s. Löwik en zijn directe medewerker Gabri van der Pluijm spoten menselijke borstkankercellen met een ingebouwd luciferasegen in bij muizen, en keken vervolgens wat er gebeurde. Terwijl op röntgenfoto’s nog niets te zien was, zagen zij met BLI dat er al heel wat uitzaaiingen waren gevormd. Sommige uitzaaiingen waren nog zo klein dat ze met geen enkele andere techniek te vinden waren. Vervolgens onderzochten ze wat het effect was van zogenaamde bisfosfonaten, die vaak worden gebruikt voor de behandeling van dit soort uitzaaiingen. Op röntgenfoto’s leken de bisfosfonaten heel effectief, doordat veel minder bot werd afgebroken. Maar met BLI konden Löwik en van der Pluijm zien dat deze stoffen geen enkel effect hadden op het aantal kankercellen. Als de muizen echter al preventief bisfosfonaten kregen toegediend, voordat de kankercellen waren ingespoten, was er wel een duidelijk effect. In dat geval werden er veel minder nieuwe uitzaaiingen gevormd. Hieruit blijkt duidelijk de toegevoegde waarde van BLI voor medisch onderzoek. Een aantal farmaceutische bedrijven wil BLI daarom gebruiken voor het testen van hun medicijnen. Voor het vervolg van dit onderzoek is Löwik bezig met muizen die zelf kanker ontwikkelen, zodat inspuiten met lichaamsvreemde cellen niet meer nodig is. Dit kan bijvoorbeeld door een muis die zelf spontaan prostaatkanker ontwikkelt te kruisen met een muis waarbij alleen de prostaat specifiek luciferase tot expressie brengt. Als de muis nu een tumor vormt in de prostaat wordt het licht in de tijd groter en groter. Als er kankercellen uitzaaien naar een ander orgaan kan je dat snel zien omdat er daar dan ook licht vandaan zal komen.

 

Toekomstdromen

In Europees verband is Löwik betrokken bij een project om kanker vroegtijdig op te sporen. Doordat BLI op dit moment alleen nog gebruikt kan worden bij muizen, is het vooral een handig hulpmiddel in het laboratoriumonderzoek, in combinatie met andere imaging-technieken zoals MRI en PET-scanning. Maar Löwik sluit niet uit dat het in de toekomst ook gebruikt kan gaan worden voor patiënten in de kliniek als diagnostische onderzoeksmethode. Hier zal het dan gaan om detectie van gemarkeerde antilichamen of andere stoffen die aan kankercellen kunnen binden, waarbij de markers fluorescent licht uitzenden in het nabije infrarood. Deze lichtfotonen hebben een nog hogere energie als die van de luciferase-reactie en kunnen dus veel dieper doordringen, tot wel 5-10 centimeter. In eerste instantie zal het dan vooral gaan om oppervlakkige tumoren als huid en borsttumoren. Maar misschien dat de verdere ontwikkeling van de glasvezel­ techniek uiteindelijk tot in ons diepste binnenste gekeken kan worden. Met name de combinatie van BLI en Fluorescentie Imaging (FLI) in het nabije infrarood biedt enorme nieuwe mogelijkheden en brengt klinische toepassing van Optical Imaging steeds dichterbij.

 

 

***Kader***

Een waaier aan mogelijkheden

 

Hieronder nog enkele interessante voorbeelden van toepassingen van Bioluminescentie Imaging (BLI):

 

Volgen van bacteriële virale of parasitaire infecties. De groep van Andy Waters van het LUMC hebben een malariaparasiet gemaakt die luciferase bevat, om deze in het lichaam te volgen en te kijken naar het effect van medicijnen. Soortgelijk onderzoek is bijvoorbeeld mogelijk voor de bacterie streptococcus Pneunomia, die longontsteking veroorzaakt.

 

Risicogenen voor kanker. Het Nederlands Kanker Instituut heeft onlangs 75 genen geïdentificeerd die een verhoogde kans op kanker geven. Löwik en van der Pluijm willen samen met andere Europese labs onderzoeken wat de functie is van deze genen met behulp van BLI.

 

Effectiviteit van gentherapie. De groep van Paul Quax van TNO Leiden is bezig met onderzoek naar een nieuwe methode van gentherapie, waarbij DNA direct in weefsel wordt ingespoten, en daarna met een electrische schok wordt ingebouwd in het DNA van de cellen. Door een luciferasegen te koppelen aan dit ingespoten DNA, is het mogelijk om precies te volgen wat er gebeurt.

 

Volgen van stamcellen. Löwik heeft samen met Duitse collega’s stamcellen ingespoten in de hersenen van muizen die een hersenbloeding hebben gehad. Met BLI kon men zien dat de stamcellen precies naar de beschadigde plek bewogen en daar sterk gingen groeien.

 

Specialisatie van stamcellen. Stamcellen in het beenmerg ontwikkelen zich tot bot, vet of kraakbeencellen. Löwik wil samen met collega’s van het UMC Utrecht onder leiding van Anton Martens bij deze stamcellen drie verschillende labels inbrengen, die elk alleen tot expressie komen in een van de drie celtypes.

 

Volgen van hormonen, zoals oestrogeen. Löwik en zijn collega’s koppelden luciferase aan de expressie van de oestrogeenreceptor, en konden zo precies zien waar en wanneer oestrogeen in het lichaam functioneert, afhankelijk van de menstruatiecyclus.

 

Enzymactiviteit volgen. Caspases zijn enzymen die andere eiwitten kapot knippen bij het afsterven van cellen. Om hun werking te onderzoeken wil Löwik luciferase zo inbouwen tussen twee andere eiwitten, dat het niet meer toegankelijk is voor luciferine. Het luciferase-eiwit komt pas vrij als de omringende eiwitten weggeknipt zijn door een specifiek caspase.

 

 

 

Effect van lokale inductie van botvorming en effect van vitamine D3 op
humane osteocalcine expressie gemeten in transgene muizen waarbij de
osteocalcine promotor gekoppeld is aan luciferase. Foto: LUMC

 

 

Botvorming zichtbaar maken.

Waar wordt precies nieuw bot aangemaakt? En wat is het effect hierop van bijvoorbeeld vitamine D? Om dit te kunnen onderzoeken, creëerden Clemens Löwik en zijn collega’s van het Leids Universitair Medisch Centrum een transgene muis, waarbij het luciferasegen is gekoppeld aan de promotor van het menselijk osteocalcinegen. Osteocalcine is betrokken bij de vorming van nieuw botweefsel en wordt alleen gemaakt op die plekken waar actief nieuw bot wordt aangemaakt. Daar wordt dus ook luciferase aangemaakt, zoals te zien is op de foto’s. Normaal gesproken wordt osteocalcine vooral aangemaakt op plaatsen met sterke mechanische belasting, zoals de enkels/pols, de staart en de onderkaak (eerste foto). Als er bij een van de pootjes een stukje beenmerg wordt verwijderd (aangegeven met een pijl), dan blijkt op die plek tijdens de daaropvolgende dagen een steeds grotere hoeveelheid osteocalcine te worden aangemaakt (foto dag 2, 5 en 9. Van vitamine D is bekend dat het de botaanmaak stimuleert. Artsen adviseren daarom om kinderen tot vier jaar dagelijks extra vitamine D geven. Met BLI is te zien dat dit vitamine D inderdaad een groot effect heeft op de botaanmaak, overal in het lichaam (laatste foto).