Om snel te checken hoe goed een klein therapeutisch molecuul bindt aan een eiwit, moet je de combinatie door een chromatografiekolom pompen. Zonder iets te hoeven labelen krijg je zo alle kinetische informatie die je nodig hebt, melden Canadese onderzoekers in Analytical Chemistry.

Sergey Krylov en collega’s van York University in Toronto gebruiken er size exclusion-chromatografie voor, een scheidingsmethode die puur selecteert op de omvang van moleculen. De grootste gaan snel door de kolom heen. De kleine moleculen worden opgehouden doordat ze nu en dan in de poriën van de stationaire fase blijven hangen.

Als detector hangt een massaspectrometer achter de kolom, die je zo afstelt dat hij alleen de kleine moleculen detecteert.

In dit geval injecteer je eerst een overmaat kleine moleculen, en spuit je het eiwit daar achteraan. Die eiwitten zijn vele malen groter en gaan dus veel harder. Na korte tijd halen ze de kleintjes in en binden er een aantal van. Die worden dus meegesleurd, maar omdat de binding reversibel is worden er geleidelijk ook weer een aantal gelost die vervolgens in hun eigen trage tempo de reis moeten afmaken.

De massaspectrometer geeft dus twee pieken met een laag bergruggetje er tussen. De eerste piek zijn de eiwitten, en vooral de kleine moleculen die er op dan moment nog aan zijn blijven hangen. De tweede piek is van de kleine moleculen die helemaal geen eiwit zijn tegengekomen. In de tussentijd komen moleculen langs die slechts een deel van de route mochten meeliften.

En uit de vorm van dit spectrogram, kun je via een door de Canadezen ontwikkeld wiskundig model heel aardig de dissociatieconstante afleiden.

Tot nu toe bepaalt men zulke constanten gewoonlijk door beide deelnemers in een oplossing met elkaar in contact te brengen. Maar om te kunnen zien wat er gebeurt moet je dan meestal één van de twee immobiliseren op een vast oppervlak, en/of voorzien van een moleculair label dat licht geeft of op een andere manier zichtbaar is te maken. Ten eerste is dat nogal bewerkelijk, ten tweede is de kans levensgroot dat het oppervlak of het label de kinetiek beïnvloedt.

Bij kinetic size-exclusion chromatography with mass spectrometry detection (KSEC-MS) zou je daar geen last meer van moeten hebben. De Canadezen probeerden het uit met acetazolamide en een carboanhydrase-enzym, en er kwam een waarde uit die redelijk dicht bij eerdere metingen lag. Voor geneesmiddelenonderzoek, waarbij je in eerste instantie vooral wilt weten welkje stoffen uit je bibliotheek duidelijk beter binden dan de rest, zou het ruim voldoende moeten zijn.

bron: C&EN