Massacytometrie combineert oude analysetechnologie tot een nieuw instrument. Immunologen kunnen inmiddels niet meer zonder, en ook andere disciplines zien mogelijkheden om er complexe weefsels mee te bestuderen.

Waarom zou je cellen blootstellen aan omstandigheden die lijken op het oppervlak van de zon? De groeiende populariteit van de elementanalyse ICP-MS (inductief gekoppelde plasma-massaspectrometrie) om cellen te identificeren, oogt op het eerste gezicht vreemd. De techniek begint namelijk met ionisatie in een helse plasmatoorts. Maar de crux zit in de stappen ervoor. Eerst stel je cellen bloot aan een cocktail van anti­lichamen, waarbij aan elk specifiek antilichaam een ander metaal is gekoppeld: antilichaam A draagt bijvoorbeeld terbium, antilichaam B europium, C dysprosium, enzovoort.

‘Je kunt er complete celpopulaties mee in kaart brengen’

Vervolgens vernevelt en ioniseert een flowcytometer de cellen stuk voor stuk. De cel verdampt en de detectie van metalen verraadt welke antilichamen gebonden zitten en daarmee allerlei celeigenschappen. Zie­daar in kort bestek het idee achter massacytometrie, ofwel cytometry by time-of-flight (CyTOF), een techniek die sinds de uitvinding in 2009 in rap tempo laboratoria verovert.

Tientallen eigenschappen

‘Ik zag de eerste CyTOF-publicaties in 2010 en dacht: als dit werkt, dan is het echt revolutionair’, zegt hoogleraar immunologie Frits Koning, werkzaam bij het Leids Universitair Medisch Centrum. ‘Je kunt er complete immunologische celpopulaties gedetailleerd mee in kaart brengen, plus de functionaliteit en de relatie met ziektes.’ In 2012 werd zijn aanvraag voor aanschaf van een CyTOF-apparaat gehonoreerd, en de levering in 2013 viel samen met de aanstelling van promovendus Vincent van Unen.

‘We kunnen in een uur tijd miljoenen cellen stuk voor stuk doormeten op dertig à veertig verschillende eiwitten, die iets vertellen over de identiteit van een cel’, vertelt Van Unen. De gangbare techniek tot nu toe was flowcytometrie op basis van fluorescentie. ‘Daarmee konden we hooguit tien à twaalf eigenschappen tegelijk in kaart brengen.’ Op die manier zie je maar een fractie, want ons immuunsysteem is een groot netwerk met verschillende takken van witte bloedcellen. Je hebt alleen al zes antilichamen nodig om een enkele tak in beeld te brengen, aldus Van Unen, en dan heb je niet veel mogelijkheden meer om activatie- en differentiatiestatussen te bepalen.

Tijdens zijn promotie keek Van Unen vooral naar darmweefsel bij chronische darmziektes als coeliakie en de ziekte van Crohn. ‘CyTOF heeft echt nieuwe inzichten gegenereerd. Zo blijkt dat niet één tak van het immuunsysteem bij ziekte ontspoort, maar dat er verschuivingen te zien zijn door het hele netwerk.’ De onderzoekers vermoeden dat die cellen onderling communiceren en zo de ontsteking in stand houden. Van Unen: ‘Zoiets kun je alleen op het spoor komen als je alle immuuncellen tegelijkertijd in kaart brengt. In plaats dat we zoeken naar de speld in de hooiberg, brengen we nu eerst de hele hooiberg in kaart, en de software vertelt ons waar de naalden liggen.’

Koning ziet CyTOF als een discovery tool: het levert nieuwe vragen en hypotheses. Je ontdekt dingen waarvan je niet wist dat ze bestonden. ‘Zo zie je subsets van immuun­cellen die we nog niet eerder in beeld kregen; zeldzame cellen die maar 0,1 % uitmaken van de populatie. Er komt in de immunologie steeds meer aandacht voor zulke zeldzame subgroepen, want er zijn aanwijzingen dat ze een belangrijke aansturende rol spelen, met name in weefsel.’

Opensourcesoftware

Data-analyse ontwikkelen vormde een belangrijk onderdeel van Van Unens promotie, herinnert Koning zich. ‘Vincent besteedde eerst negen maanden aan cellen meten, vervolgens zat hij zes maanden achter zijn computer om de data te analyseren.’ Zoveel tijd kostte een grondige analyse van 5,2 miljoen cellen met 32 markers toen nog, nu kan het drie keer zo snel. Je kijkt in feite naar miljoenen cellen in 32 verschillende dimensies. ‘Vincent heeft veel tijd gestoken in statistische analysetools ontwikkelen en data visualiseren. Want visualisatie is de manier om CyTOF data begrijpelijk te maken. Kleurrijke grafieken met puntenwolken laten zien hoe het immuunsysteem uiteenvalt in verschillende celsoorten en subgroepen.’

Van Unens onderzoek en samenwerking met de Delftse groepen van Thomas Höllt en Boudewijn Lelieveldt hebben geleid tot de opensourcesoftware Cytosplore. Van Unen: ‘Dat programma is heel gebruiksvriendelijk. Je kunt eenvoudig CyTOF-data inlezen en de algoritmes toepassen.’ Onder­zoekers met minder CyTOF- en programmeerervaring maken er dankbaar gebruik van.
In theorie zou je volgens Koning honderd verschillende antilichamen kunnen labelen. De immunologie komt echter metalen te kort om de diversiteit van het imuunsysteem in kaart te kunnen brengen. In de praktijk zijn er nu maar zo’n 42 metalen beschikbaar. Van Unen: ‘Als je nieuwe metaallabels wilt toepassen, heb je twee obstakels. Ten eerste moeten de metalen isotopisch zuiver zijn. Ten tweede zit er een uitdaging in de chemie die metalen aan antilichamen koppelt.’

Hartregeneratie

Massacytometrie trekt ook aandacht van andere onderzoeksvelden. ‘De techniek vindt nu vooral toepassing in immunologisch onderzoek, maar ik hoop dat ze uiteindelijk ook is te gebruiken voor onderzoek naar hartregeneratie’, zegt Jop van Berlo, assistant professor bij The Stem Cell Institute en Lillehei Heart Institute van de University of Minnesota. ‘De kracht van CyTOF is dat het veel meer informatie kan geven over cellen in complexe weefsels. Mijn belangrijkste hindernis was dat een goede methode ontbrak om te bepalen welke cellen allemaal bijdragen aan hartregeneratie. Er was geen makkelijke manier om vermenigvuldigend DNA te labelen, bijvoorbeeld in een muis.’

De data-analyse kan nu drie keer zo snel

Een collega van Van Berlo, chemicus Valerie Pierre, kende wel een aantal chemische bouwstenen om zo’n label te construeren. Ze ontwikkelden een tweestapmethode, waarover Van Berlo en collega’s onlangs publiceerden in Scientific Reports. Eerst krijgen cellen een synthetische DNA-bouwsteen aangeboden: ethynyldeoxyuridine (EDU). Vervolgens koppel je via klikchemie een terbium-azide probe (DOTA) aan EDU. DNA label je zo met terbium en de massacytometer kan vervolgens laten zien of een cel recentelijk is gevormd.
Van Berlo: ‘De kracht van de probe is dat hij verschillende lanthaniden kan cheleren. We hebben in eerste instantie terbium gebruikt, omdat het maar een isotoop heeft en relatief goedkoop is. Maar je kunt een ander lanthanide kiezen als dat beter past, afhankelijk van de metalen die je al gebruikt in de antilichamen.’

Een van de belangrijkste vragen rond hartgeneratie is volgens Van Berlo in welke mate zich nieuwe cellen vormen. ‘Ik hoop dat we met deze techniek dat soort vragen kunnen gaan beantwoorden. We weten nog niet of nieuwe hartcellen afkomstig zijn van delende hartspiercellen of van stamcellen. Op dit moment volgen onderzoekers een enkel celtype en negeren ze alle andere celsoorten. Met CyTOF kun je veel breder gaan kijken en het hele landschap in kaart brengen.’