Eiwitten met niet-natuurlijke aminozuren kun je het beste kweken in een extract van zwaar gemodificeerde coli’s. De modificaties voorkomen dat het eigen proteoom van de bacteriën jouw plannen in de weg zit, schrijven Michael Jewett en collega’s van Northwestern University in Nature Communications.

Ze hebben het dan over een productiemethode die bekend staat als cell-free protein synthesis (CFPS). Daarbij begin je met het doden van de bacteriën in je kweekje, en het afbreken van hun celwanden. De vloeistof die overblijft (lysaat, in vakjargon) bevat nog het complete eiwitsynthesemechanisme. Als je er aminozuren, een moleculaire energiebron en DNA of RNA naar keuze aan toevoegt, blijft dat mechanisme gewoon draaien. Het voordeel is dat je overal bij kunt; zo wordt het bijkvoorbeeld veel makkelijker om met afwijkende aminozuren te werken dan wanneer de bacterie er nog omheen zit.

Maar om zo’n niet-natuurlijk aminozuur te kunnen inbouwen moet je er een eigen genetische drielettercode aan toekennen, en de eiwitconstructiemachinerie uitbreiden met transfer-RNA dat de nieuwe bouwsteen aandraagt. Als code gebruik je meestal ‘amber’ oftewel UAG, een van de drie stopcodons die normaal gesproken het einde van de eiwitcode aangeven.

Probleem is dan alleen dat release factor 1, het eiwit dat normaal gesproken op zo’n stopcodon reageert en het rijgen van aminozuren afbreekt, óók nog gewoon in het lysaat zit. In de praktijk gaat het concurreren met je toevoegingen. Soms wordt het afwijkende aminozuur ingebouwd en loopt de synthese gewoon door; soms wordt ze afgebroken en hou je een half eiwit over.

Jewett lijkt nu als eerste op het idee te zijn gekomen om het lysaat van gewone E.coli te vervangen door dat van een gemodificeerde stam waar dat hele stopcodon niet meer in zit. Die zogeheten C321.ΔA-stam is het werk van Harvard-coryfee George Church: UAG kwam er 321 keer in voor en die zijn allemaal vervangen door een ander stopcodon, UAA. Vervolgens kon het gen voor release factor 1 er uit worden gesloopt zonder dat de bacterie het gaat missen.

Het C321.ΔA-lysaat blijkjt inderdaad een prima basis voor een CFPS dat afwijkende aminozuren zoals p-azido-L-fenylalanine kan inbouwen.

Als proof of principle heeft Jewett er zogeheten ELP’s mee gemaakt, ketens van repeterende sequenties van vijf aminozuren die formeel eiwitten zijn maar die je in de praktijk beter kunt beschouwen als biopolymeren. Als je daar niet-natuurlijke aminozuren in wilde zetten, moest je ze tot nu opbouwen uit natuurlijke aminozuren die je achteraf chemisch modificeerde. Anders wurmde release factor 1 zich er telkens tussen en kreeg je alleen korte stukjes. Met het C321.ΔA-lysaat lukt het tamelijk moeiteloos om ketens te maken met maximaal 40 repeterende sequenties, en dus ook 40 niet-natuurlijke aminozuren, zonder dat die stukjes aantoonbaar waren.

bron: Northwestern University