In de archeologie moet je constant de balans vinden tussen behoud en je eigen nieuwsgierigheid. Je kunt zeldzame vondsten bekijken met alle analysemethoden die je tot je beschikking hebt, maar het materiaal zal verloren gaan en je weet dat de beschikbare methoden over een paar jaar nog preciezer en gevoeliger zullen zijn. Wanneer is dan het juiste moment om de resten de analyseren? En hoeveel van het sample ga je vernietigen om te achterhalen wat er in zat? De instrumenten moeten gevoelig genoeg zijn om met hele kleine hoeveelheden te werken, zodat er voldoende van de originele vondst overblijft voor toekomstige generaties.

In de afgelopen vijftien jaar vond er een technologische revolutie plaats in de massaspectrometrie (MS) en proteomics. MS werd ongeveer duizend keer gevoeliger en dat is van groot belang voor archeologische analyses, omdat er meestal maar heel weinig materiaal beschikbaar is. Dat leidde tot een nieuw en snelgroeiend veld in de moleculaire wetenschap: paleoproteomics, oftewel eiwitsequentiebepaling inzetten om soorten en evolutionaire relaties te identificeren. Als je deze technologie toepast op biologische samples in archeologische vondsten zoals voedselresten op potscherven, vind je informatie over onze voorouders die voorheen onbereikbaar was.

Tot voor kort keken paleobiologen vooral naar DNA, maar eiwitten hebben een aantal voordelen vergeleken met DNA. Zo blijven ze langer en beter bewaard: de secundaire structuur van eiwitten kan wel 40.000 jaar overleven. Bovendien geeft DNA alleen de genetische informatie, maar het fenotype (de eigenschappen die tot uiting komen in het organisme) valt er niet mee te achterhalen. Eiwitten daarentegen bevatten alle informatie over het fenotype van een levend organisme. Daarnaast kunnen eiwitresten in aardewerk iets zeggen over voedselgebruiken.

Konijnencollageen

Maarten Dhaenens is opgeleid tot veldbioloog, maar schakelde om naar de moleculaire biologie en specialiseerde zich de afgelopen zeventien jaar in massaspectrometrie van eiwitten. Nu is hij teamleider van het proteomics lab van de afdeling farmaceutische biotechnologie aan de Universiteit Gent. Zijn lab neemt deel aan een project van archeoloog prof. dr. Isabelle de Groote (UGent), waarin de migratie, het dieet en de gezondheid van de eerste permanente bewoners van hedendaags België centraal staan. Dhaenens analyseerde eerder de eiwitten in een verfschilfer van beroemde Gentse schilderwerk Het Lam Gods (dd. 1432) en vond konijnencollageen in de verf. Voor het onderzoeksproject van De Groote moet hij echter een stuk verder terug in de tijd kijken.

De resten waar dit nieuwe project om draait komen uit het Mesolithicum (12.000-13.000 jaar geleden) en zijn zeer schaars. De Groote en haar team willen het verleden reconstrueren op basis van deze beperkte vondsten. Met paleoproteomica is veel mogelijk, maar het is een nieuw veld en soms is het initiële enthousiasme te groot. Dhaenens: ‘Onderzoekers hangen soms een heel verhaal op aan de vondst van één peptide. Maar hoe interpreteer je die vondst? Hoe zeker ben je van je zaak? De eiwitrestanten in de samples zijn zeer minimaal en in het verleden zijn soms te snel te grote conclusies getrokken.’

‘Dagelijks leven is het interessantst. Wat aten ze? Hoe maakten ze dat klaar?’

Özge Demirci

Melk

In hun vooronderzoek analyseerden ze met succes residu op een potscherf uit het Neolithicum (7000 jaar geleden), aangeleverd door professor Philippe Crombé, en vonden onder meer melk, vis en runderbloed. De archeologen waren zeer verbaasd, vooral over de melkpeptiden, want voor zover bekend hielden de mensen uit die tijd nog geen dieren. Dat betekent ofwel een grote ontdekking, ofwel een fout in de analyse. Helaas konden ze hun resultaten niet reproduceren, omdat het residu na de eerste analyses op was.

Dhaenens: ‘De archeologen trapten op de rem. Hoe zeker zijn we van die annotatie? Kan de melk via het lab in het sample terecht gekomen zijn, bijvoorbeeld door morsen of omdat er andere analyses gedaan zijn in het lab? Daarna wil je bepalen van welk organisme de melk komt. Was het een rund of kan een bacterie een peptide hebben dat lijkt op melk. Pas als je al die dingen hebt uitgesloten, kun je zeggen dat de meest plausibele verklaring is dat er 7000 jaar geleden iemand melk kookte in die pot of er uit gedronken heeft. We moeten heel zeker zijn voor we zoiets publiceren. Daarom ben ik blij dat er in Nederland vergelijkbare resultaten zijn gevonden voor dezelfde periode.’

Dhaenens verwijst naar het werk van onder meer Özge Demirci, die vetresten op Swifterband aardewerk (7000-5800 jaar oud) uit het Neder-Rijngebied analyseerde tijdens haar promotieonderzoek aan de Rijksuniversiteit Groningen en York University. Ze probeerde uit deze vetresten te achterhalen wanneer de overgang van jager-verzamelaars naar landbouwers plaatsvond en gebruikte GC-MS en GC-C-IRMS. Ze deed haar analyses in York, omdat er in Nederland geen gespecialiseerd lab is. Ook zij vond zuivel, maar durft niet te zeggen dat de mensen melk produceerden of dronken. ‘We vonden visresten in alle samples, maar slechts één keer zuivel.’

Demirci heeft nog geen eiwitanalyses gedaan op potresten, maar zou dat in de toekomst graag doen. ‘Het geeft meer informatie. Vooral als ik naar zuivel kijk – van welk dier komt dat dan? Botresten en DNA-analyse leveren niet zoveel bewijsmateriaal.’ Demirci’s fascinatie met potresten is gegroeid tijdens haar promotieonderzoek. ‘Eigenlijk wilde ik me nooit specialiseren in aardewerk, want het leek me zo saai. Maar door de nieuwe analysemethoden is het een ongelofelijk rijk veld. Ik heb olie gevonden die die mensen daadwerkelijk gebruikten en ik voel nu een connectie met die mensen. Dagelijks leven is het interessantst. Wat aten ze, hoe maakten ze dat klaar? De potresten bevatten het antwoord.’

X of Y

Dhaenens en collega’s gebruiken een conventionele bottom-up proteomics workflow. Dat betekent dat ze alles wat overschiet aan eiwitten knippen met het enzyme trypsine en het resulterende peptidemengsel met de MS analyseren. Specifiek met Q-TOF instrumenten, quadrupole time of flight. Dhaenens: ’Dat geeft hele hoge massaresolutie: accuraat tot op 10 ppm, een fractie van het gewicht van een proteïne. Op basis van het spectrum kunnen we de peptiden identificeren.’

Als analytisch wetenschapper hield Dhaenens zich voorheen vooral bezig met histonen die epigenetische veranderingen ondergaan. Later kwam daar SARS-CoV-2 diagnose bij, forensische proteomics en nu paleoproteomics. Dat laatste spreekt meer tot de verbeelding dan histonen, zegt Dhaenens. ‘Als we naast elkaar skeletten vinden van een vrouw en een kind, gaan we daar direct verhalen aan koppelen. Was dat haar zoon of dochter? Dat appelleert aan een breder publiek en alleen al daarom willen we die vraag beantwoorden.’

Met paleoproteomics kun je redelijk eenvoudig geslachtsbepaling op tanden doen. Vanwege de harde matrix, de tand, blijven eiwitten daarin vaak goed bewaard. Het amelogenine in tandglazuur is bij mannen en vrouwen een anders vanwege de X en Y chromosomen. Dhaenens: ‘Als we type Y vinden in het tandglazuur weten we zeker dat het een man was, als we geen Y vinden was het wellicht een vrouw. We zijn nu een assay aan het ontwikkelen waarmee we kunnen berekenen hoe zeker we van onze zaak zijn als er geen Y is.’

‘We moeten steeds de afweging maken hoeveel materiaal we opofferen’

Maarten Dhaenens

Isotopenprofiel

Het zijn vragen die ze tien jaar geleden niet hadden kunnen beantwoorden. Naast de revolutie in de massaspectrometrie zijn er ook nieuwe data-analyse workflows ontwikkeld. Met MS zetten de onderzoekers een biologisch sample om in getallen, vervolgens heb je bio-informatica nodig om te reconstrueren waar dat sample uit bestond. Ook dat veld is de afgelopen tien jaar enorm gegroeid, vooral door de komst van machine learning. Dhaenens: ‘We werken samen met de groep van Lennart Martens uit Gent (zie ook het interview, red.). Zij kunnen het spectrum van een peptide voorspellen met een machine learning algoritme. Als wij maar één peptide detecteren kunnen zij de spectra tegen elkaar zetten en kijken hoe goed de meting overeen komt met de voorspelling. Dat geeft extra vertrouwen dat we naar het juiste kijken.’

Dit onderstreept volgens Dhaenens het belang van interdisciplinair werken. Het project van De Groote tracht antwoorden over het Mesolithicum te vinden in een samenwerking van onder meer archeologen, antropologen en bio-ingenieurs. Die laatste doen bijvoorbeeld isotoopanalyse. Het isotopenprofiel van een individu is het gevolg van wat die persoon heeft gegeten. In het Mesolithicum waren er voor zover bekend nog geen potten, dus de onderzoekers proberen peptiden te linken aan gedrag en dieet voor een periode waarvan ze wél scherven hebben, zoals het Neolithicum. Vervolgens hopen ze op basis van isotoopcombinaties in botten iets te zeggen over de situatie van langer geleden.

Het project is pas net begonnen en omdat resten uit het Mesolithicum zo schaars zijn, zal Dhaenens voorlopig Middeleeuwse restanten analyseren om de protocollen te optimaliseren. Deze zijn een stuk makkelijker te vinden. Ze gebruiken skeletten uit een opgraving onder de Sint-Baafs kathedraal in Gent en proberen zoveel mogelijk eiwit uit de botten te halen. Het protocol dat het meeste eiwit oplevert, gaan ze vervolgens toepassen op een mesolithisch sample. ‘Dan moeten we heel voorzichtig te werk gaan en zo min mogelijk materiaal verbruiken. In de toekomst gaat er meer mogelijk zijn, dus we willen zo veel mogelijk sample bewaren, maar we willen ook nu al onderzoek doen, want we zijn ongeduldig. Archeologen en analytisch chemici moeten steeds de afweging maken hoeveel materiaal we opofferen.’

Stempel

Dhaenens hoopt zelf meer informatie te vinden over het dieet op de Neolithische potscherven, zoals eiwitten, zonnebloemzaden, bloed van runderen of vissen en natuurlijk melk. ‘Ander onderzoek over de hele wereld heeft soortgelijke restanten gevonden op nog veel oudere potscherven, dus die diëten bestonden wel degelijk. Dat zijn intuïtieve en duidelijke resultaten: die eiwitten zitten in die potten omdat mensen ze voor dat voedsel hebben gebruikt.’

Iets wat ze nog niet kunnen met eiwitanalyse, maar graag zouden doen is de leeftijd ten tijde van sterven bepalen aan de hand van menselijke resten. Archeologen kunnen veel zeggen aan de hand van de morfologie van die resten, maar als je slechts hele kleine fragmenten vindt, kan eiwitanalyse in de toekomst wellicht uitkomst bieden. ‘Er zijn zogenaamde age-biomarkers die alleen voorkomen in mensen tot veertien jaar. Voor volwassenen is dat moeilijker, maar misschien zijn er eiwitten die pas op latere leeftijd ter expressie komen.’

Het mooiste vindt Dhaenens hoe mensen 7000 jaar geleden hun moleculaire stempel hebben achtergelaten die we nu nog kunnen zien. ‘Die moleculen hebben door de tijd gereisd en nu zijn ze bij ons. Directer kun je ze niet schetsen. Zij hebben over millennia een stempel achtergelaten waar ze zich totaal niet bewust van waren. Ik besef nu des te meer dat ze over een paar duizend jaar wellicht ook iets van mij kunnen zien.’