Metabolieten zijn meer dan alleen afbraakproducten en bouwstenen voor complexe macromoleculen. De Zwitserse Anne-Claude Gavin vermoedt dat ze ook een belangrijke signaalfunctie hebben in levende cellen.

Maar liefst de helft van het volume van een cel bestaat uit metabolieten. Enzymen hebben een grote invloed op hun bestaan. Ze kunnen metabolieten in tweeën knippen of juist aan elkaar koppelen. Over de omgekeerde rol, waarbij de chemische wereld van de metabolieten het functioneren van de eiwitwereld beïnvloedt, is vele malen minder bekend.

Op dit moment zijn er tussen metabolieten en eiwitten nog maar tien à twintig interacties bekend waarbij de metaboliet als signaalmolecuul bindt aan een enzym of eiwitcomplex waarvoor hij niet het substraat vormt. Zoals een metaboliet uit de citroenzuurcyclus die aan een membraanreceptor bindt. In zo’n geval verandert zo’n metaboliet het functioneren van het enzym of eiwitcomplex. Hoeveel interacties wetenschappers uiteindelijk zullen vinden, durft biotechnoloog Anne-Claude Gavin niet te schatten. “Maar ik denk dat zulke interacties uiteindelijk meer de norm dan de uitzondering zijn.”

“Het is eigenlijk net als bij mensen. We kunnen wel dingen alleen, maar als je iets voor elkaar wilt krijgen, moet je samenwerken met anderen”, licht Gavin toe, die eind februari in Utrecht een van de sprekers was op het jaarlijkse congres van het Netherlands Proteomics Centre (NPC). “In een cel is het waarschijnlijk hetzelfde. We hebben dat al in een publicatie in Nature laten zien voor eiwitcomplexen die een cel als een soort basismodules kan koppelen aan verschillende andere complexen. Zo beschikt een cel over een soort voorgefabriceerde eiwitelementen waarmee ze snel eiwitmachines kan bouwen.”

VERDENKING

Zowel membraanreceptoren als eiwitten met een signaalfunctie en receptoren in de cel zijn door metabolieten te beïnvloeden, denkt Gavin. Om welke eiwitten in een cel het dan gaat? “Ik verdenk ze allemaal. Ik vermoed dat het bij veel eiwitten mogelijk is. Er zijn immers veel medicijnen die ingrijpen op zulke receptoren. Goede kans dat er ook natuurlijke analoga bestaan van de synthetische moleculen die als medicijn gebruikt worden.”

Tegelijkertijd kan het opsporen van nog onbekende interacties tussen eiwitten en metabolieten ook weer nieuwe aangrijpingspunten voor medicijnen opleveren. “De variatie in metabolieten en eiwitten is tijdens de evolutie tegelijkertijd ontstaan en in de loop der tijd zal dat zinvolle interacties opgeleverd hebben. Als je die vindt, kun je het effect van het metaboliet ook weer met een synthetisch analogon nabootsen.”

BALLETJES

“We zijn tot nu toe relatief blind geweest voor interacties tussen metabolieten en enzymen, mede omdat we nog weinig gereedschappen hebben om ze te onderzoeken”, stelt de Zwitserse, die tegenwoordig bij de European Moleculair Biology Laboratory in het Duitse Heidelberg werkt.

Oftewel, het onderzoeken van de eiwit-metabolietinteracties vraagt om nieuwe experimentele technieken. “Ik zou graag op glasplaatjes metabolietenarrays maken, vergelijkbaar met DNA-chips. Ik verwacht dat dat eerst op de universiteiten zal gebeuren voordat fabrikanten van analyseapparatuur deze technieken gaan aanbieden.”

Gavin geeft een voorbeeld van een chip met zestig vetzuren erop, waarop je 122 eiwitten kunt testen die volgens voorspellingen mogelijk een vetzuurbindend domein hebben. Als je van tevoren een TAP-label (zie kader) hangt aan die mogelijk vetzuurbindende eiwitten, kun je de complexen snel met tandem-affinity purification opzuiveren en met massaspectrometrie analyseren.

Verder kun je ook een techniek van haar oud-collega’s van het biotechbedrijf Cellzome gebruiken. Met deze zogenoemde kinobeads, kleine balletjes waaraan je metabolieten of chemische analoga daarvan hangt, kun je eiwitten die een interactie aangaan met deze metabolieten uit een cel vissen (zie onder).

Eiwitten als complex uit de cel vissen

Wie zo veel mogelijk eiwitcomplexen uit de cel wil vissen, slaat graag de lastige en tijdrovende stap over van het maken van een heel scala aan specifieke antilichamen. Een TAP-label en tandem-affinity purification (TAP) leveren een goed alternatief.

De truc is om te werken met genetische gemodificeerde cellen die zelf een eiwit labelen, nadat je een genconstruct voor het TAP-label hebt ingebracht. Zo kun je de eiwitcomplexen die rondom dit gelabelde eiwit in de cel ontstaan bijna onder fysiologische omstandigheden opzuiveren om ze vervolgens met massaspectrometrie te analyseren.

Met het TAP-label plakken cellen als het ware een extra staartje aan een groot eiwit. Aan het ene uiteinde zit proteïne A, waaraan een antilichaam zit gekoppeld dat kan binden aan de chromatografiekolom. Aan het andere uiteinde zit een calmodulinebindend peptide, dat nodig is voor de tweede zuiveringsstap.

Nadat het complex via het antilichaam aan de kolom is vastgehaakt, is het complex weer op een milde manier van de kolom te krijgen met specifieke proteases die het TAP-label middenin doorknippen. Een tweede zuiveringsstap maakt ook weer gebruik van chromatografie, maar dit keer bindt het overgebleven stukje van de TAP-staart, het calmodulinebindende peptide in aanwezigheid van calcium aan een kolom met calmoduline. De gezochte eiwitcomplexen zijn nu met EDTA, een stofje dat het calcium wegvangt, van de kolom af te krijgen.

En dan is het scheidingswerk gedaan. Nu moet je het nog even in stukjes hakken met proteases en de bestanddelen van het complex zijn klaar voor de massaspectrometer.

Kinobeads: eiwitten vangen met metaboliet

Bolletjes waar moleculen aanhangen die op ATP lijken, vormen een goede methode om kinases uit een cel te vissen, die ATP gebruiken om substraten te fosforyleren. Op deze manier zijn deze vaak niet in grote hoeveelheden vookomende eiwitten vervolgens toch met MS te analyseren, terwijl hun concentratie zonder zuiveringsstap te laag is om goede pieken op te leveren. Kinobeads noemt Bernhard Kuster van het Duitse biotechbedrijf Cellzome de bolletjes.

Met de kinobeads zijn ook kinaseremmers te testen in levende cellen in plaats van in een reageerbuisje met opgezuiverde eiwitten. Kinases zijn enzymen die vaak een belangrijke functie hebben in de cel, omdat ze signalen aan andere eiwitten doorgeven door er een fosfaatgroep aan te hangen, waarna die eiwitten van locatie kunnen veranderen in de cel of bijvoorbeeld een associatie met andere eiwitten kunnen aangaan.

Met de Kinobeads vis je de kinases, die ook in veel ziekteprocessen een rol spelen, uit de cel en vervolgens voeg je remmers toe. En dan kan de competitie tussen de remmers en de ATP-mimics op de bolletjes beginnen. Zo kun je volgens het bedrijf Cellzome in een enkel experiment je kinaseremmer, waarvan je denkt dat het een potentieel medicijn is, in één keer ín de cel testen op tweehonderd verschillende kinases. Dit terwijl je zowel je potentiële remmer als de kinases niet hoeft te labelen. De eiwitten zijn daarna te analyseren met massaspectrometrie voor identificatie van het eiwit en om de mate van fosforylering te bepalen.

Bron: C2W life sciences6