Voor het eerst kun je met twee verschillende Ramanspectroscopietechnieken zowel strekbewegingen op Ångströmschaal als individuele moleculen in biologische systemen analyseren. ‘Er bestaat nog geen theorie voor onze observaties.’

Ramanspectroscopie gebruik je normaliter om informatie te winnen over vibraties en rotaties in moleculaire systemen. Om nog preciezer te kunnen meten, zijn twee Amerikaanse onderzoeksgroepen onafhankelijk van elkaar met verschillende technieken aan de slag gegaan: tip-enhanced-Ramanspectromicroscopie (TER-SM) en stimulated Raman-excited fluorescence (SREF).

TER-SM is een combinatie van scanning probe-microscopie, laserspectroscopie en oppervlaktewetenschappen. De resolutie van die techniek hangt af van de grootte van de probe en de afstand tot dat wat je wilt meten. Om een moleculaire resolutie te krijgen, moet je dus heel dicht op een vastgezet, vlak molecuul gaan zitten.

Dit kan met Co(II)-tetrafenyl porfyrine (CoTPP) wanneer je het immobiliseert op een Cu(100)-oppervlak bij extreem lage temperaturen, volgens een studie in Nature uit april van Joonhee Lee uit de groep van Vartkess Ara Apkarian aan de University of California, Irvine. ‘Voor Ångström­resolutie moet het molecuul stilstaan en daarom bevriezen we het bij een temperatuur van 5 K’, vertelt Apkarian.

 

Nog geen theorie

Het werkt als volgt: neem een zilveren, microscopisch kleine punt die je op minder dan 3 Å (0,3 nm) afstand van CoTPP op het koperoppervlak brengt. De punt werkt als een antenne en versterkt het elektromagnetische signaal dat de probe uitzendt in velden op vierkante nanometerschaal. Door zo dichtbij te meten, komt CoTPP plat op het oppervlak te liggen en kun je heel precies de individuele vibratiemodi van de molecuulbindingen bepalen en bekijken.

‘Jarenlang was het uitgangspunt van de nabijeveldmicroscopiecommunity dat de grootte van de probe de best haalbare resolutie zou limiteren’, vertelt Lee. ‘Met andere woorden, de krommingsstraal van de microscopische punt bepaalt de resolutie, zoals de punt van een balpen de dikte van de lijn bepaalt.’ Wetenschappers dachten dat de realistische straal zo’n 20 nm zou zijn. Op die schaal zou atomische ribbelvorming geen probleem zijn.

Het werk van Lee en collega’s toont nu aan dat de excitatie en de scattering van Ramanprocessen zich beperken tot het atoom dat zich op de apex van de punt bevindt. ‘Maar omdat er nog geen theorie is die kan verklaren wat we precies hebben waargenomen, ontwikkelen we een nieuwe taal om te beschrijven wat we zien’, vervolgt Lee. ‘We hebben bijvoorbeeld de licht-materie-interactie versimpeld tot elektrische velden van geladen deeltjes. Die velden vormden zich tijdens kwantumtunnelovergangen en daarmee hebben we de normaalverdeling van het Raman­signaal beredeneerd.’

Er moet nog wel een volledige kwantummechanische beschrijving komen voor de observatie, omdat het gemeten fenomeen in het kwantumtunnelregime valt. ‘Volgens mij is het belangrijkste aspect van ons werk echter de atomische plaatsbepaling van licht’, stelt Lee. Met de techniek die het team ontwikkelde, kon het de flow van elektronen door het molecuul laten zien. Dat wil zeggen, de onderzoekers verkregen spectra van de verschillende rek- en strekbewegingen van CoTPP bij verschillende golflengtes.

De groep heeft al plannen om de techniek uit te diepen, aldus Lee. ‘Onze volgende stap is TER-SM verrijken met meer dimensies. Momenteel werken we aan temporele TER-SM, waardoor we de mogelijkheid krijgen om filmpjes van moleculaire vibraties op te nemen.’

 

‘We ontwikkelen een nieuwe taal om te beschrijven wat we zien’

Ook al zijn de resolutie en het detail dat TER-SM bereikt indrukwekkend, het grote nadeel van dit systeem is dat het onder cryogene en ultrahoogvacuümcondities moet gebeuren, wat metingen aan biologische systemen moeilijk en onrealistisch maakt. ‘Ons werk verlegt de grens van de ruimtelijke resolutie wel naar het atomische, maar dat heeft ook de nodige vereisten’, geeft Apkarian toe.

 

Positieve combinatie

De onderzoeksgroep van Wei Min aan Columbia University, New York, probeerde een andere manier om informatie van opzichzelfstaande moleculen te visualiseren. De onderzoekers combineerden Raman­spectroscopie met fluorescentie. Fluores­centie heeft een zeer lage detectiegrens; individuele moleculen kun je zichtbaar maken door er bijvoorbeeld een fluorescente probe aan te hangen. Een nadeel is echter dat het op zichzelf weinig chemische informatie bevat, alleen dat er een molecuul aanwezig is.

Ramanspectroscopie is daarentegen uitermate geschikt om chemische informatie te halen uit moleculen. Maar het moeilijke aan die techniek is dat ze over het algemeen heel ongevoelig is. De onderzoekers van Columbia University combineerden de positieve kanten van fluorescentie en Raman­spectroscopie en lieten op die manier de nadelen achterwege, wat resulteerde in SREF.

‘Het is een spectaculaire ontwikkeling in de niet-lineaire optische microscopie, ofwel NLO’, vertelt Apkarian. ‘Ze brengen de single molecule-sensitiviteit van fluorescentie en de chemische selectiviteit van stimulated Raman samen. In onze groep gebruiken we een andere manier: IR-excitatie gevolgd door twee-fotonfluorescentiemicroscopie. Maar Min en collega’s hebben alle andere pogingen overtroffen.’

 

Kleurstofisotopoloog

SREF werkt met drie verschillende lasers. De eerste twee laten het te analyseren molecuul via stimulated Ramanscattering (SRS) in de intermediaire vibratietoestand terechtkomen. De derde straal zorgt ervoor dat de vibratietoestand opwaarts converteert naar de elektronische excitatietoestand, waarna fluorescentie optreedt, zo schrijven hoogleraar Min en promovendus Hanqing Xiong in Nature Photonics twee dagen voor de Nature-publicatie van Lee.

Het team van Columbia finetunede zijn theorie en aanpak met de kleurstof ATTO 740. Daarna bekeken de onderzoekers of ze nog preciezer konden meten. Ze gebruikten daarvoor de populaire kleurstof Rhodamine 800 (Rh800), die vergeleken met ATTO 740 hogere fluorescente waarden heeft, en synthetiseerden een aantal nieuwe isotopen in de nitrilgroep van het molecuul: 12C≡15N, 13C≡14N en 13C≡15N.

 

Voor moleculaire resolutie moet je heel dicht op een molecuul gaan zitten

Die vier isotopologen van Rh800 hebben exact dezelfde absorptie- en emissiespectra en zijn in principe dus niet te onderscheiden met standaardfluorescentietechnieken. Maar met SREF kun je de verschillende isotopologen laten zien aan de hand van de C≡N-vibraties, die allemaal net van elkaar verschillen. ‘Kleur wordt zo een tweedimensionaal concept’, meent Min. Elke kleur kun je dan definiëren met zowel de Raman- als de fluorescentiefrequenties.

 

Significante mijlpaal

Mins team wilde de techniek vervolgens uitdiepen met multiplexed SREF-beeld­vorming. ‘Er is een steeds grotere vraag naar het tegelijk zichtbaar maken van een groot aantal moleculaire targets in complexe systemen’, schrijven de onderzoekers in het artikel. Maar bij analyses met fluorescentie loop je tegen een zogenoemde ‘kleurenbarrière’ op doordat er niet genoeg chemische specificiteit is. In de praktijk kun je namelijk maar ongeveer vijf kleurstoffen tegelijk laten zien.

Om de kracht van multiplexed SREF te demonstreren, kleurden Xiong en collega’s levende E. coli met de vier isotopologen en mengden ze de vier verschillend gekleurde stammen. Met de techniek konden ze vervolgens precies zien welke bacterie met welk isotopoloog gemerkt was en dus door de kleurbarrière heen breken, en dat allemaal bij kamertemperatuur. De volgende stap is SREF combineren met super­reso­lutiemicroscopietechnieken.

Apkarian besluit: ‘De gevoeligheid om individuele moleculen te zien met chemische selectiviteit is inderdaad een significante mijlpaal voor NLO-microscopie. Maar als Å-resolutie niet per se nodig is, kunnen wij met onze techniek ook gemakkelijk dezelfde sensitiviteit en selectiviteit bij kamertemperatuur laten zien.’