Kort door de bocht zijn cellen niets anders dan kleine chemische fabrieken. Op papier ideaal voor de productie van chemicaliën, in de praktijk valt het vaak vies tegen. ‘Het probleem is dat het substraat, veelal glucose, zijn elektronen doneert aan de redox-cofactor NAD, en die elektronen worden daarna verdeeld over biomassa, product en eventuele bijproducten’, legt Maaike Remeijer uit. Remeijer, promovendus systeembiologie aan de Vrije Universiteit Amsterdam, is deel van een consortium dat vat wil krijgen op hoeveel elektronen er uiteindelijk voor het product beschikbaar zijn. 

Dat doen ze door redox-cofactoren te gebruiken anders dan het gebruikelijke NAD en NADP om zo de productie van chemicaliën los te koppelen van de rest van het metabolisme. ‘En dat is best wel revolutionair. Door er een derde cofactor naast te gebruiken, zet je de boel op z’n kop’, zegt Ruud Weusthuis, hoogleraar Microbiële Biotechnologie aan Wageningen University & Research (WUR). De niet-canonieke redox-cofactor dat het consortium erbij zet is nicotinamidemononucleotide,NMN. Het doel: zorgen dat de cel deze derde cofactor ook daadwerkelijk gaat gebruiken. 

‘Ik heb nu twee alternatieve metabole routes die koolstof mogelijk naar het centrale metabolisme kunnen brengen’

Tim Althuis, Wageningen UR

Om de cel hiertoe te verplichten passen ze GAPDH, glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase – dat essentieel is voor de anaerobe omzetting van glucose – zo aan dat het alleen nog maar NMN als cofactor kan gebruiken. Vervolgens passen ze een tweede enzym zo aan dat deze alleen nog maar NMNH kan gebruiken, zodat je een gesloten keten krijgt die de geproduceerde NMNH weer omzet in NMN. 

Lees verder onder de foto

NMN binden 

Hierbij komen veel uitdagingen kijken. Ten eerste moet de cel NMN gaan maken. Dat is waar Noor van Wijk, promovendus microbiële biotechnologie bij de WUR, aan werkt. ‘NMN wordt van nature gemaakt door E. coli als precursor van NAD, maar de concentratie is erg laag’, zegt Van Wijk. Om de concentratie van NMN te verhogen ging Van Wijk op zoek naar enzymen die NMN kunnen maken. Nu ze deze heeft gevonden kijkt ze wat het effect op de cel is van de hogere NMN-concentratie. ‘Gaat de cel er, bijvoorbeeld, minder goed van groeien en waar komt dat dan door?’ 

Een tweede uitdaging is ‘dat op het moment dat alle van het substraat afkomstige elektronen naar het product gaan, er geen elektronen overblijven voor de groei en onderhoud van de cel’, zegt Tim Althuis. Althuis zoekt als promovendus Microbiologie aan de WUR naar een manier om een kleine hoeveelheid koolstof en energie beschikbaar te maken voor groei en onderhoud. ‘Ik heb nu twee alternatieve metabole routes die koolstof mogelijk naar het centrale metabolisme kunnen brengen’, zegt Althuis. Een daarvan is aeroob, de ander is zowel aeroob als anaeroob en het is nu testen of die de cel in leven kunnen houden.  

‘Tot nu toe lukte het om een drie tot vier keer hogere activiteit van GADPH in de aanwezigheid van NMN te krijgen’

Caroline Paul, TU Delft

Als derde is er het aanpassen van de enzymen zodat ze alleen nog maar NMN(H) als redox-cofactor kunnen gebruiken. Dat is waar een promovendus uit de groep van universitair hoofddocent biokatalyse Caroline Paul van de TU Delft, aan werkt. ‘Dit zijn eigenlijk twee problemen’, legt Paul uit. ‘Ten eerste is er het uitsluiten van NAD(H).’ Omdat NMN korter is dan NAD is dit relatief eenvoudig. NAD bindt GAPDH namelijk door zijn staart in een holle ruimte van dit enzym te schuiven. Vullen ze deze ruimte op dan is de activiteit van GADPH 98% lager in aanwezigheid van NAD. ‘Daarnaast moet je ervoor zorgen dat het kortere NMN zich ook aan GAPDH bindt’, zegt Paul. Dit komt omdat NMN geen staart heeft waarmee het in de juiste positie gehouden kan worden. ‘Tot nu toe lukte het om een drie tot vier keer hogere activiteit van GADPH in de aanwezigheid van NMN te krijgen, maar dat moet natuurlijk meer zijn.’. 

Om een geïnformeerde keuze te maken bouwen ze in Delft een database van het effect dat individuele mutaties op de activiteit van het enzym hebben. Die gebruiken ze vervolgens weer om combinaties van die mutaties te testen. Daarnaast schakelen ze in Wageningen de hulp van gestuurde evolutie in. ‘Als je ervoor zorgt dat een enzym bijvoorbeeld alleen maar NMNH kan maken, dan functioneren die micro-organismen het beste als er ook een tegenenzym is dat NMNH kan gebruiken’, zegt Weusthuis. Waarbij de verwachting is dat gestuurde evolutie een handje helpt om NMNH effectiever aan dit tegenenzym te binden. 

Lees verder onder de foto

Metabolisme voorspellen 

Lukt het om dit allemaal voor elkaar te krijgen, dan is de grote vraag: wat doet het organisme? ‘Het erbij zetten van een nieuwe cofactor raakt de basis van het hele organisme. Wat er gaat gebeuren weten we niet precies’, zegt Weusthuis. Een van de gevolgen kan zijn dat het organisme de derde cofactor er na verloop van tijd uit gooit. Maar er zijn meer mogelijkheden, denkt Althuis: ‘De hoeveelheid vrij beschikbare NMNH in de cel is misschien wel zo groot dat reacties die nu, vanwege de ongunstige thermodynamica, niet plaatsvinden, dan wel mogelijk zijn.’ 

‘Het is ook gewoon een wiskundig probleem’

Maaike Remeijer, VU  

Om daar meer grip op te krijgen modelleert Remeijer het microbieel metabolisme. ‘Zo kan ik advies geven over de mogelijke genen die je moet toevoegen of moet verwijderen voor het gewenste resultaat, om bijvoorbeeld de gewenste balans te krijgen tussen het producerende en het groeiende deel van een organisme.’ De NMN-bevattende micro-organismen van het consortium produceren nu nog melkzuur en ethanol. ‘Maar er zijn natuurlijk een heleboel andere opties waar we dit concept op kunnen toepassen’, zegt Remeijer. Daarom zijn ze bij de VU ook bezig met het ontwikkelen van een computerprogramma dat andere opties kan voorspellen om de gewenste balans te krijgen.  

Maar wanneer je bedenkt dat alleen al in E. coli 2500 reacties plaats vinden, en dat er op z’n minst 56.000 biochemische reacties zijn, dan wordt dat voorspellen nog een hele opgave. ‘Al is het ook gewoon een wiskundig probleem’, relativeert Remeijer. Wanneer dat lukt, dan is het niet ondenkbaar dat micro-organismen ook aromaten, bulkchemicaliën, farmaceutische stoffen en geurstoffen uit bijvoorbeeld afvalwater kunnen maken.