Gentechnologie CRISPR-Cas is een bejubelde techniek waarmee je genen snel en nauw­keurig kunt aanpassen. Toch heeft die nauwkeurigheid grenzen. Hoe laat je CRISPR-Cas alleen op de beoogde plek knippen?

Als je genen aanpast met CRISPR-Cas is er een kans dat knipeiwit Cas9 verkeerd knipt. Het knipt dan niet de unieke DNA-doelsequentie, maar een die er sterk op lijkt. ‘Er is nog maar weinig bekend over de zogenoemde off target-effecten van CRISPR-Cas’, zegt Annemieke Aartsma-Rus, hoogleraar translationele genetica aan het Leids Universitair Medisch Centrum. ‘Veel onderzoekers zeggen dat ze die effecten niet zien, maar ze kijken er ook niet echt naar.’ Als je CRISPR-Cas wilt inzetten voor gentherapie is van belang om dergelijke onbedoelde neveneffecten in kaart te brengen.

Geen knip maar knik

Volgens Daniël Warmerdam, CRISPR-consultant en -onderzoeker bij Cancer Center Amsterdam, zijn er nog niet veel voorbeelden van toepassingen in gentherapie. ‘Wel zijn er al een aantal muismodellen, die er heel succesvol uitzien. Het uiteindelijke idee bij mensen is dat je stamcellen van een patiënt neemt, die verandert en dan weer terugbrengt.’ Dan kun je de DNA-sequentie zowel voor als na het knippen bepalen. ‘Je plaatst alleen de cellen terug waarbij geen sprake is van off-targets.’ Of dit op lange termijn nodig blijft voor veilige gentherapie is nog onduidelijk. Warmerdam: ‘Misschien dat het op termijn een acceptabel risico wordt, maar voorlopig is dat zeker nog nodig.’

‘Met de promotor knipt Cas9 alleen waar je wilt’

Nadat het CRISPR-pakket in de goede cellen is afgeleverd, moet dit het DNA nog steeds op de juiste plek bewerken. ‘Een van de methodes om DNA te veranderen, is een breuk maken en die dan laten repareren zoals jij dat wilt’, zegt Warmerdam. ‘Omdat nuclease Cas9 niet superexact is, bestaat er een kans dat het op een plek knipt waar je dat niet wilt. Maar er zijn nu wel drie nieuwe verbeterde versies van Cas9 die dat significant veel minder doen.’ En het is tegenwoordig ook mogelijk om DNA aan te passen zonder echte breuk. Warmerdam: ‘Je kunt een versie van Cas9 inzetten die geen knip maakt, maar een knik. Als dat op de verkeerde plek gebeurt, zijn de gevolgen veel minder erg.’

Sommige onderzoekers zijn dus specifiek bezig de veelbesproken gentechnologie nauwkeuriger te maken. ‘Maar ook andere onderzoekers die met CRISPR-Cas werken, proberen off-targets te voorkomen door een geschikt gids-RNA te vinden’, vertelt Warmerdam. Dit RNA leidt CRISPR-Cas naar de goede plek in het DNA door basenparen te vormen. Als je de DNA-sequentie weet, kun je dus van tevoren een geschikt gids-RNA kiezen. ‘Het is een kwestie van eerst werken aan een supergoed systeem en dan bekijken hoe je dat in de goede cellen kunt afleveren’, besluit Warmerdam.

Virale vectoren

Ook Aartsma-Rus benadrukt hoe belangrijk en moeilijk het is om een CRISPR-pakket bij de beoogde cellen af te leveren. Zeker in het geval van een ziekte als Duchenne-spierdystrofie, waarop zij zich richt. ‘Cellen uit het lichaam halen, bewerken en weer terugplaatsen is onbegonnen werk, omdat je meer dan zevenhonderd spieren moet bereiken. En gecorrigeerde cellen via het bloed afleveren werkt ook niet goed, omdat die de spieren dan nauwelijks bereiken.’

Er zijn wel onderzoekers die werken aan een behandeling van Duchenne op DNA-niveau met CRISPR-Cas, maar dat is nog in de fase van de cellen en muismodellen. Terwijl het onderzoek van Aartsma-Rus op RNA-niveau in Europa al wordt getest in fase 3 klinische studies en in de VS al is goedgekeurd. ‘Werken op RNA-niveau heeft als nadeel dat je de patiënt elke week, of elke twee weken opnieuw moet behandelen, want het RNA en de geproduceerde eiwitten blijven niet functioneel.’

‘Het lijkt er soms op dat mensen niet willen horen dat CRISPR ook fouten maakt, maar als je klinisch gaat testen, moet je daar wel naar kijken.’

Het Duchenne-onderzoek draait zowel op DNA- als op RNA-niveau om exon skipping. Door het stukje DNA of RNA over te slaan dat de mutatie bevat, herstel je de functie van het niet-werkende spiereiwit dystrofine gedeeltelijk. Je geneest de genetische ziekte dus niet, maar zorgt wel voor een milder ziektebeeld.

Aartsma-Rus legt uit dat je bij de behandeling van Duchenne heel voorzichtig wilt zijn. ‘Je wilt geen risico lopen dat er iets misgaat als je iemand van 4 jaar behandelt, die zonder behandeling een levensverwachting heeft van zo’n 30 jaar. Als iemand in het laatste stadium van kanker zit, zijn die risico’s minder relevant. Zo heeft chemotherapie ook veel schade aan het DNA tot gevolg, maar wordt het toch veel gebruikt.’ Volgens Aartsma-Rus is er meer systematisch onderzoek nodig. ‘Het lijkt er soms op dat mensen niet willen horen dat CRISPR ook fouten maakt, maar als je klinisch gaat testen, moet je daar wel naar kijken.’

‘Voor een goed systeem zijn drie dingen relevant: efficiëntie, specificiteit en de werking in vivo om het klinisch relevant te maken’, vindt ook Thierry Vanden­Dries­sche, hoogleraar gentherapie aan de universiteiten van Brussel en Leuven. Met collega’s werkte hij aan een systeem om effectief genen aan te passen in de lever van muizen. Het resultaat publiceerden zij begin maart in Molecular Therapy. In plaats van cellen te isoleren, te bewerken en terug te plaatsen, leverden ze het CRISPR-knip­pakket direct af in muizen in met virale vectoren. ‘Het lastige is wel dat het totale pakket erg groot is en normaal gesproken niet in één vector past.’

‘Ik ben hoopvol en optimistisch, maar ook realistisch’

Het gebruik van een kleine synthetische promotor is een van de aanpassingen die nodig waren om dit wel voor elkaar te krijgen. ‘De promotor is klein, maar toch erg krachtig en specifiek voor de levercellen. Daardoor knipt Cas9 alleen daar en niet op plekken waar je dat niet wilt, zoals in het hart’, zegt VandenDriessche. Ook het gids-RNA pasten ze aan. ‘We gebruikten truncated RNA, wat betekent dat er een stukje mist. Daardoor is het specifieker voor een bepaalde DNA-sequentie. We lieten zien dat dit in vivo niet ten koste gaat van de efficiëntie.’

Hoopvol

VandenDriessche vond geen bewijs van off-target-effecten, terwijl hij hier wel naar zocht. ‘Met een computeranalyse voorspelden we wat de meest waarschijnlijke plekken daarvoor zijn. De top drie analyseerden we vervolgens uitgebreid met deep sequencing.’ Met die techniek test je een bepaalde regio in het DNA zo vaak dat je de code tot op de nucleotide precies weet. Om helemaal zeker te zijn dat er geen neveneffecten optreden wanneer je het DNA aanpast, zou je het hele genoom moeten sequencen. VandenDriessche: ‘Maar dat deze drie plaatsen niet beschadigd waren geeft zeker hoop, al is dit onderzoek dus nog wel in de fase van muismodellen.’

‘Hopelijk kan het platform een basis vormen om ziektebeelden als hemofilie in de toekomst te behandelen’, zegt Vanden­Driessche. ‘Ik ben hoopvol en optimistisch, maar ook realistisch. Er zijn vaak meerdere routes om hetzelfde ziektebeeld te behandelen. Daarom denk ik dat het goed is dat we verschillende pistes bewandelen.’