Een enkel eiwit in beeld brengen met elektronenmicroscopie was vijf jaar geleden nog een promotiewaardige klus. Nu is het routine. Structuren zichtbaar maken in levende cellen is de nieuwe uitdaging voor cryo-EM.

In vrijwel elke structuurbiologische publicatie van de laatste paar jaar gebruiken onderzoekers cryo-EM om de structuur van de onderzochte biomoleculen op te helderen. Je zou bijna vergeten dat die vorm van elektronenmicroscopie pas recentelijk doorbrak. Nederland speelde hierin een belangrijke rol. ‘De technologie op het gebied van sensoren, beeldvorming en data-analyse waarmee cryo-EM echt kon doorbreken, is tussen 2003 en 2008 ontwikkeld met Nederlands onderzoeksgeld’, zegt Peter Peters, hoog­leraar nanobiologie aan Maastricht University.

De technologische voorsprong die dat opleverde, maakt dat tot op heden vrijwel alle cryo-EM-apparaten in de wereld in de regio Eindhoven worden gebouwd. En de beste apparatuur voor samplevoorbereiding in Limburg. Peters: ‘Het is prachtig dat onderzoekers die cryo-EM lang beschouwden als ‘blobologie’ nu toonaangevende publicaties realiseren door hun voor röntgenkristallografie opgezette eiwitbibliotheken door de cryo-EM-wasstraat te halen. Maar we mogen de mensen niet vergeten die met vallen, opstaan en wetenschappelijke tegenwind deze techniek zo toegankelijk hebben gemaakt.’

Capaciteit

Om ervoor te zorgen dat Nederland ook bij het gebruik van de hier ontwikkelde toptechniek in de voorhoede kan blijven meelopen, kende de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO) half april € 17 miljoen steun toe aan NEMI, de Nederlandse Elektronen Microscopie Infra­structuur, de overkoepelende organisatie van Nederlandse EM-centra die de opbouw coördineert van infrastructuur voor cryo-EM. Dat geld is hard nodig, weet Christoph Diebolder, senior scientific operator bij het Nederlands Centrum voor Elekt­ronen Nanoscopie NeCEN in Leiden, waar de meest krachtige cryo-EM apparaten van Nederland staan.

‘Die data opslaan vormt al een enorme uitdaging’

Ontwikkelingen op het gebied van de sensitiviteit van detectoren, de mate van automatisering en data processing hebben de technologische doorbraak van de laatste jaren mogelijk gemaakt. ‘Maar de toepassing van cryo-EM blijft een uitermate kostbare zaak’, zegt Diebolder. ‘Experimenten duren lang, met algauw enkele weken beamtime per experiment en daarna weken tot maanden rekentijd om alle data te verwerken. De benodigde apparatuur kost in aanschaf rond de € 6 miljoen en de servicecontracten om de apparaten draaiende te houden zijn ook tonnen per jaar.’ Dat houdt de beschikbaarheid van de techniek beperkt. Diebolder vervolgt: ‘We moeten de binnen Nederland beschikbare capaciteit daarom zo slim mogelijk inzetten en goed kiezen waar we het eerst en het laatst naar gaan kijken. Zeker nu cryo-EM andere technieken als NMR en kristallografie gepasseerd is als eerste keus om structuren op te helderen.’

Nederlands cryo-EM-onderzoek moet vooral de goede vragen stellen, meent ook Friedrich Förster, hoogleraar cryo-EM aan de Universiteit Utrecht. En goede samples maken. ‘De vraag naar cryo-EM neemt snel toe. De infrastructuur blijft echter beperkt. Nederland maakt de beste apparatuur, maar de grootste afnemers zitten in het buitenland. Wij moeten ons in Neder­land onderscheiden door efficiënt gebruik van de beschikbare middelen.’

Cellen en weefsels

Förster ziet kansen in de samplepreparatie om het huidige arsenaal efficiënter te kunnen gaan inzetten . ‘Nu blijkt vaak pas na de data-analyse wat de kwaliteit van het onderzochte sample was. Als we ons in een eerder stadium kunnen vergewissen van de kwaliteit van de samples, kunnen we ervoor zorgen dat elk schot raak is. Dat verkort de gemiddelde experimenteertijd sterk.’

Voor routinematig toegepast onderzoek en diagnostiek blijft cryo-EM volgens de experts voorlopig te kostbaar. Maar het blijft niet bij het ophelderen van de structuur van single particles. ‘Met de snelheid waarmee we nu in de wereld cryo-EM-faciliteiten opbouwen, kijkt over vijf jaar niemand daar nog van op’, denkt Peters. ‘In China staan volgend jaar veertig sterke cryoelektronenmicroscopen. Het genoom van de mens codeert voor rond de twintigduizend eiwitten. Het is een kwestie van tijd tot die allemaal in beeld zijn gebracht.’

Onderzoekers in Nederland kijken daarom alvast verder naar de structuur van biomoleculen in hun natuurlijke omgeving, in cellen en zelfs weefsels. Peters: ‘Ik werk al dertig jaar aan transmembraaneiwitten in witte bloedcellen. Maar ik kan ze pas sinds drie weken ook echt in die cellen zien zitten!’ ‘Eindelijk kunnen we veel van de schematische tekeningen in de studieboeken van de moleculaire biologie gaan vervangen door foto’s’, bevestigt Förster. ‘En in de fysiologische context zien wat er nu eigenlijk gebeurt als we bijvoorbeeld kankercellen proberen te bestrijden met antilichamen.’

‘De toepassing van cryo-EM blijft uitermate kostbaar’

Het eindelijk echt kunnen kijken in de cel brengt naast verrassende nieuwe informatie over de biologische structuren ook weer nieuwe technische onderzoeksvragen met zich mee. Peters: ‘We zijn uit de studieboeken gewend aan mooi ingekleurde cartoons, maar met cryo-EM zien we nu nog alles in hetzelfde ‘grijs’. Dat maakt verschillende structuren herkennen en onderscheiden nog een hele puzzel. Dat is op te lossen door de verschillende eiwitten uit te rusten met verschillende fluorescente vlaggetjes. Dat gereedschap is nu volop in ontwikkeling.’

Snelle inzage in 80 terabyte

Het blijft een uitdaging om cellen en (kunstmatige) orgaantjes te ‘verglazen’ in plakjes die dun genoeg zijn voor elektronenmicroscopie. Verder spelen nieuwe vraagstukken rond de opslag en uitwisseling van de omvangrijke hoeveelheid data die elk cryo-EM-experiment genereert. Peters: ‘Voor wetenschappers is het van belang dat onze experimenten reproduceerbaar zijn. Maar hoe geef je een onderzoeksgroep in Baltimore even snel inzage in 80 terabyte aan onderzoeksdata uit Maastricht? En dat zijn dan nog maar de data van één experiment. Alleen die data opslaan vormt al een enorme uitdaging.’

Toch lijkt dergelijke belemmeringen wegnemen vooral nog een kwestie van tijd en geld. Diebolder: ‘Het beste voorbeeld van de grensverleggende kracht van cryo-EM is niet één voorbeeld, maar dat er op dit moment wekelijks een brede reeks nieuwe voorbeelden wordt gepubliceerd.’