Combinatie van elektronenmicroscopie en fysisch-chemisch redeneren.

De Eindhovense elektronenmicroscopist Nico Sommerdijk heeft geen reden tot klagen. Begin april schoof de Euro­pean Research Council hem een advanced grant toe van € 3,5 miljoen, om de rol van niet-collagene eiwitten bij de mineralisatie van collageen in menselijke botten voor het eerst goed in beeld te brengen. Een paar dagen later kende onderzoeksfinancier NWO € 17,3 miljoen toe aan Netherlands Electron Microscopy Infrastructure (NEMI), een samenwerkingsverband van de Nederlandse elektronenmicroscopielabs, waaronder dat van Sommerdijk – dat bedrag wordt niet in Eindhoven uitgegeven, maar toch. En even daarvoor haalde Sommerdijk Nature met een onderzoek naar het ontstaan van eiwitkristallen dat voor het eerst uitzicht geeft op mogelijkheden om dit proces actief te sturen.

Dat kristallisatieproces start met een handvol eiwitmoleculen die vanuit de oplossing spontaan een kiem vormen. Hoe dat precies werkt, was tot nu toe onduidelijk. En ook niet waarom sommige eiwitten last hebben van polymorfisme: er kunnen verschillende kristalvormen ontstaan, die met name qua oplosbaarheid nogal verschillen. Voor geneeskundige of industriële toepassingen is dat niet handig.

Met cryo-transmissie-elektronenmicroscopie (cryo-TEM) blijk je die kiemen nu voor het eerst gedetailleerd genoeg in beeld te kunnen krijgen om iets te zeggen over het vormingsproces. ‘Cryo’ wil daarbij zeggen dat je kiemende oplossingen heel snel bevriest, en de bevroren samples onder de elektronenmicroscoop legt. Dat herhaal je met een aantal identieke samples, telkens op een ander moment tijdens het kristallisatietraject.

Uitzouten

Sommerdijk, stadgenoot Heiner Friedrich, de Brusselse vorser Mike Sleutel en de aan de Université Rhône-Alpes in Grenoble werkzame Belg Alexander Van Driessche hebben dit uitgeprobeerd met glucose-isomerase. Van dit enzym, dat glucose en fructose in elkaar omzet, zijn twee kristalvormen en een amorfe gelachtige structuur bekend. De 3D-structuur van het losse eiwit is al eerder opgehelderd; het ziet er ongeveer uit als een vierkant, opgebouwd uit vier losse bolletjes.

‘Cryo-TEM brengt kiemen tot in detail in beeld’

De microscoopbeelden zijn nét scherp genoeg om die grondvorm te kunnen herkennen, en om te kunnen zien hoe deze grondvormen zich stapelen tot de kiemen voor een kristal. Eerst vormen zich staafvormige ketens van eiwitmoleculen. Die gaan vervolgens naast elkaar liggen en vormen zo iets dikkere vezels waaruit weer nanokristallen kunnen groeien. Zo krijg je een van beide polymorfen. Hoe de andere wordt opgebouwd is nog niet helemaal duidelijk, maar hij lijkt direct uit de oplossing te ontstaan zonder vezels als tussen­stadium.

Amorfe gel

Zo’n kristallisatieproces breng je normaal gesproken op gang door de oplosbaarheid van de eiwitmoleculen in water kunstmatig te verlagen. Dat zogeheten uitzouten is een kwestie van ammoniumsulfaat of polyetheenglycol (PEG) toevoegen. Welke van de twee je kiest, en in welke concentratie, blijkt in dit geval bepalend voor de polymorf. Een beetje ammoniumsulfaat of PEG geeft langzame, maar rechtstreekse kristalgroei. Iets meer PEG of véél ammoniumsulfaat levert staafjes en vezels op, en met heel veel PEG klonteren de eiwitten te snel en krijg je de amorfe gel.

Om te begrijpen hoe dat kan, moet je eerst goed naar de cryo-TEM-plaatjes kijken. Die verraden welke hoeken van de eiwitmoleculen tegen elkaar gaan liggen. Uit de reeds bekende 3D-structuur van die losse moleculen kun je daarna afleiden welke aminozuurbouwstenen zich op die hoeken bevinden, en dus betrokken moeten zijn bij die onderlinge binding. Wat het effect van ammoniumsulfaat of PEG op de afzonderlijke aminozuren is, is een kwestie van fysische chemie en thermodynamica.

De laatste stap in de redenering is dat je het ontstaan van de minder gewenste polymorf in principe moet kunnen verhinderen door een paar aminozuren op de hoeken te vervangen. Met een beetje handigheid hoeft dat niet ten koste te gaan van 3D-vorm en functionaliteit van het losse eiwit. Het wachten is op iemand die dit daadwerkelijk uitprobeert.