Het Cas3-knipeiwit haalt als een hengelaar het DNA binnen, dat het wil verknippen. Het idee dat het zichzelf langs dat DNA verplaatst kan naar de prullenmand, schrijven de Delftse onderzoekers Luuk Loeff, Stan Brouns en Chirlmin Joo in het tijdschrift Molecular Cell.

Wie daar geen abonnement op heeft, kan op de preprintserver bioRxiv terecht voor een conceptversie.

Cas3 wordt onder meer aangemaakt door E. coli, als onderdeel van een bacterieel afweersysteem dat hetzelfde doet als het bekendere CRISPR-Cas9 maar wat ingewikkelder in elkaar zit. Cas3 is zowel een helicase als een nuclease: het kan dubbelstrengs DNA ontvlechten én het kan een enkele streng in stukken knippen.

Daarbij werkt het samen met een eiwitcomplex genaamd Cascade, ooit door Brouns ontdekt toen hij nog promovendus was. Cascade bindt dubbelstrengs DNA en legt het naast de CRISPR-bibliotheek, die is gevuld met ongewenste sequenties. Is er een match, dan legt het contact met een toevallig voorbijkomend Cas3-eiwit, dat een stukje verderop het DNA aan stukken knipt.

En over dat laatste waren tot nu toe twee theorieën: het translocation model waarbij Cas3 zichzelf weer loskoppelt van Cascade en al knippend langs de streng beweegt, en het reeling model waarbij het aan Cascade gekoppeld blijft en het DNA al knippend binnenhaalt.

Tot nu toe had de eerste mogelijkheid de meeste aanhangers maar Loeff en collega’s laten nu zien dat de tweede de juiste is. Ze toonden het aan via Förster resonance energy transfer (FRET), een populaire techniek waarbij je werkt met met twee verschillende moleculaire labels, die fluoresceren zodra ze bij elkaar in de buurt komen.

Een reeks experimenten laat zien dat Cas3 inderdaad het dubbelstrengs DNA, dat uit het Cascade-complex steekt, langzaam binnenhaalt. Daarbij wordt één van beide strengen door het nucleasegedeelte van Cas3 gevoerd en in stukjes geknipt, terwijl het andere een steeds groter wordende lus vormt tussen Cas3 en Cascade.

Het doet vermoeden dat Cas3 wordt geactiveerd door Cascade, en niet kán knippen zonder direct contact met dat complex. Wat dan wel zal moeten voorkómen dat Cas3 op eigen houtje in actie komt en het eigen DNA van de bacterie verknipt.

De FRET-experimenten geven tevens een idee van de manier waarop Cas3 werkt. Het helicase ontvlecht het DNA basenpaar voor basenpaar maar het lijkt met sprongetjes van drie basenparen te werken. De onderzoekers denken dat dat komt doordat het uiteinde van de lus een soort veermechanisme vormt: het drukt tegen de buitenkant van het helicase en na drie ontvlochten basenparen wordt de druk zó groot dat Cas3 drie posities verderop wordt gedrukt.

Opvallend daarbij is dat het hele mechanisme ook blijkt te kunnen slippen, en dát zou weer moeten zijn omdat het nuclease-gedeelte relatief inefficiënt werkt en extra tijd nodig heeft om te knippen.

bron: TU Delft, bioRxiv