Hoe bepaal je nog onbekende, mogelijk giftige stoffen in water? Geautomatiseerde toxiciteits­tests kunnen een oplossing bieden, leert de nieuwe FractioMate van de Vrije Universiteit Amsterdam en partners.

Brandvertragers, medicijnresten, gewasbeschermingsmiddelen, microplastics, weekmakers, coatings: onze rivieren, sloten en meren bevatten vaak honderden stoffen die mogelijk giftig zijn voor mensen en waterdieren. Daaronder zitten veel bekende, maar ook veel onbekende, nieuwe stoffen. Denk bijvoorbeeld aan GenX-stoffen, die sinds een paar jaar dienen als hulpstof voor coatingproductie.

De waterschappen en drinkwaterbedrijven willen graag weten welke toxische stoffen in het water zitten, om mens en natuur hiertegen te beschermen. Maar hoe test je efficiënt op zo veel, ook nog onbekende, stoffen? En hoe kijk je naar de gezamenlijke effecten van stoffen die afzonderlijk niet veel doen?

Hiervoor werkt de Vrije Universiteit Am­sterdam (VU) samen met partners uit de waterwereld al een paar jaar aan automatisering en miniaturisering van zogenoemde effect-gestuurde analyses: high through­put effected directed analysis (HT-EDA). Het is een combinatie van chemische en toxicologische technieken waarvoor in steeds meer landen belangstelling is.

‘De prijs zit vooral in de massaspectrometer’

Laboratoria testen hierbij niet meteen op mogelijk toxische stoffen, maar kijken eerst naar de biologische effecten die het watersample heeft in biologische testsystemen, zoals in-vitrotests met eiwitten, bacteriën of cellen. Beïnvloedt het watersample de werking van een hormoon, of heeft het mutagene effecten op het DNA? Eventuele effecten zijn vervolgens leidend voor de chemische analyses met een massaspectrometer.

Kosten en kennis

Eind 2017 kwam een eerste instrument op de markt dat, door automatisering en miniaturisering, het tot nog toe vrij tijdrovende onderzoekstraject versnelt: de FractioMate. ‘Met hulp van de FractioMate kunnen gespecialiseerde laboratoria binnen een of twee weken de estrogene activiteit van watersamples bepalen, en een globaal idee krijgen van welke stoffen daarvoor verantwoordelijk zijn’, zegt Marja Lamoree, onderzoeker bij Environment & Health.

De FractioMate is ontwikkeld binnen een project van Technologiestichting STW dat werd uitgevoerd in 2012-2017. De afdelingen biomolecular analysis en environment & health van de VU zijn hiervoor in zee gegaan met apparatuurleverancier Spark Holland uit Emmen.

Het zou mooi zijn als de effect-gestuurde analyses (HT-EDA) uiteindelijk zo eenvoudig zijn dat waterbeheerders ze zelf zouden kunnen doen, met een handzaam apparaatje in het veld, waarna op hun mobieltje de verdachte chemicaliën verschijnen. Maar zover is het nog lang niet. ‘Voorlopig zullen vooral gespecialiseerde laboratoria deze geautomatiseerde analyse in opdracht van waterbeheerders of overheden uitvoeren’, zegt Lamoree. ‘De kosten zijn niet zozeer de FractioMate, als wel de massaspectrometer die nodig is om de onbekende stoffen te identificeren.’ Prijzen daarvoor kunnen wel rond de half miljoen euro liggen. Daarnaast is veel kennis nodig om de verkregen uitkomsten te kunnen interpreteren.

Sneller en preciezer

Het Waterlaboratorium in Haarlem, dat water onderzoekt voor drinkwaterbedrijven en andere organisaties in de waterketen, is een gespecialiseerd laboratorium. Het gebruikt de FractioMate al sinds 2016, omdat het een van de partners was in het STW-project. ‘We scheiden de stoffen uit het watersample eerst met behulp van chromatografie, waarbij water over scheidingskolommen gaat’, vertelt Corine Houtman, toxicoloog bij het Waterlabora­torium. ‘Vervolgens verdeelt de Fractio­Mate de stoffen over 384 kleine welletjes van een kunststofmicrotiterplaatje.’ Het apparaat zorgt ervoor dat, vanuit de chromatograaf, automatisch minuscule fracties van 35 µl reproduceerbaar in de welletjes belanden, met een snelheid van 250 µl per minuut. Omdat dit niet meer met de hand hoeft te gebeuren, versnelt dit het traject en maakt het preciezer.

‘Welletjes zonder activiteit kunnen we overslaan’

In de welletjes worden de fracties getest op estrogene, androgene of glucocorticoïde activiteit. Die bevatten daarvoor genetisch gemodificeerde menselijke cellen met receptoren voor die hormonen, plus een enzym (luciferase) dat tot expressie komt wanneer een stof de receptoren triggert. Na toevoeging van een substraat voor het luciferase, kunnen laboranten de eventuele respons meten. De welletjes die oplichten bevatten dan de biologische activiteit, en dus stoffen die een hormoonwerking hebben.

Intussen analyseert de massaspectrometer de samenstelling van fracties, zodat de chemicus of laborant aan de hand van eigenschappen als molecuulmassa en isotoopverhoudingen kan achterhalen welke stoffen in de actieve fracties zitten. Hout­man: ‘Dit heeft als voordeel dat we alleen van die welletjes de data van de massaspectrometer verder te hoeven onderzoeken, en de welletjes waarin geen activiteit is kunnen overslaan. Ook dit versnelt de zoektocht naar giftige stoffen.’

Flexibel platform

Het lukt niet altijd de identiteit van de stoffen te vinden. Hiervoor moet je namelijk de massaspectra en de toxicologische eigenschappen vergelijken met die van bekende moleculen in een database. Maar die databases zijn nooit volledig, omdat er zo veel nieuwe stoffen op de markt komen. Gaat het om een nog onbekende industriële stof, dan kunnen laboratoria afhankelijk zijn van de fabrikanten om definitief te kunnen vaststellen om welke stof het gaat. De fabrikant moet de zuivere stof leveren, om het massaspectrum en de toxische respons te kunnen vergelijken met de gevonden stof.

Maar ook als het niet lukt stoffen precies te identificeren, levert de effect-gestuurde analyse de waterbeheerders informatie op. De activiteit in de fracties zorgt namelijk voor een piekenpatroon waarvan je al veel kunt aflezen. Zo leert het aantal pieken of het gemeten effect door een of meerdere stoffen is veroorzaakt. En bijvoorbeeld de plaats van een piek (afhankelijk van de snelheid waarmee een stof door de chromatograaf kwam) zegt vaak al iets over het type stof. Dat maakt het platform ook flexibel. Houtman: ‘Een laboratorium kan hiermee zelf bepalen hoever het gaat. Misschien is het niet nodig altijd het volledige platform te doorlopen tot en met de chemische identificatie van individuele stoffen. Soms wil je alleen maar de toxiciteit van twee plaatsen met elkaar vergelijken.’

Meer toxiciteitstests

Met de FractioMate is een flinke stap gezet naar commerciële inzet van effect-gestuurde analyses, maar er moet ook nog veel gebeuren. Want met het HT-EDA-platform kun je nu alleen de mutageniteit en de hormoonverstorende activiteit meten. Er moeten dus nog meer toxiciteitstests komen. In een nieuw, door onderzoeksinstelling NWO-TTW gefinancierd project, RoutinEDA (tot 2021), willen de partners daarom geautomatiseerde tests ontwikkelen die zijn gericht op antibiotica, stoffen die oxidatieve stress veroorzaken, en geneesmiddelen zoals diclofenac en ibuprofen.

Daarnaast zijn de mogelijkheden voor automatisering en miniaturisering veel breder dan voor alleen water. Lamoree: ‘We hopen uiteindelijk dit platform ook te kunnen inzetten voor om nog onbekende toxische stoffen te vinden in bloed- en urinesamples en in bouwmaterialen.’