Eind vorig jaar berichtte C2W over een draagbare bacterietester die de Universiteit van Maastricht ontwikkelt. Hoe ver staat het onderzoek nu?

In mei publiceerden Bart van Grinsven en collega’s van de UM een vervolg op hun eerdere studie naar het creëren van een bacteriedetectieplatform in ACS Infectious Diseases. Eind vorig jaar besteedde C2W al aandacht aan die eerste publicatie, nadat de publieksmedia de draagbare test ten onrechte hadden gehypet als dé snelle test voor MRSA (zie artikel ‘Testresultaten onder de loep’). Zo ver blijkt het ook nu nog niet te zijn. ‘Maar MRSA blijft natuurlijk wel de heilige graal’, vertelt Van Grinsven.

 

Subspecies onderscheiden

‘Het grote verschil met de vorige publicatie,’ vertelt de Maastrichtse onderzoeker, ‘is de uitleesmethode.’ In plaats van heat-transfer method (HTM) gebruikt hij nu thermal wave transport analysis (TWTA). ‘Dat levert een twee keer hogere sensitiviteit op. Aan de chip die zorgt voor de benodigde selectiviteit hebben we niets veranderd.’ (zie kader ‘Chip’ onderaan het artikel)

Vorig jaar vroeg C2W Aart van Amerongen, werkzaam bij Wageningen University & Research als hoofd van de groep biosensing & diagnostics, om een reactie op de publicatie. Zijn opbouwende kritiek heeft ons zeker verder gebracht, aldus Van Grinsven. ‘Zo lukte het ons deze keer om niet slechts twee bacteriesoorten, E. coli en S. aureus, te kunnen onderscheiden, maar een totaal van negen bacteriesoorten die de Wereldgezond­heidsorganisatie als belangrijk aanduidt.’

Een volgende stap is subspecies kunnen onderscheiden, zoals E. coli en E. coli K12, kortom twee stammen van dezelfde soort. ‘Daar treedt, waar ik vorig jaar al op vooruitliep, inderdaad cross-selectivity op’, zegt Van Grinsven. ‘Maar ik had verwacht dat onze methode beide soorten helemaal niet uit elkaar zou kunnen houden, zeg maar een flat line zou geven. Dat is niet zo. We hebben een idee hoe we dit verder kunnen oppakken, maar daar kan ik nu nog niets over zeggen.’

 

‘Onderscheid maken tussen subspecies zal moeilijk blijven’

Van Amerongen haakt hierop in: ‘Ik vermoed dat het met deze insteek moeilijk zal blijven om onderscheid te maken tussen subspecies. In hun discussie melden de Maastrichtse onderzoekers dat de selectiviteit van hun methode vermoedelijk wordt beïnvloed door de aan- dan wel afwezigheid van suikereenheden op transmembraaneiwitten van de bacteriën. Ik zou daarom eerder spreken van kruisreactiviteit: het feit dat subspecies overeenkomstige structuurelementen hebben, blijft de detectie in de weg zitten.’

Van Grinsven reageert: ‘Als blijkt dat de herkenningspunten die een onderscheid vormen tussen verschillende subtypes binnen eenzelfde soort zich vooral binnen in de cel uiten, wordt het inderdaad een moeilijk verhaal.’ De Maastrichtse methode maakt namelijk onderscheid op basis van de buitenkant van bacteriën. ‘We meten de bacterie als entiteit, we isoleren geen DNA. Dat maakt de test sneller, maar je pakt geen informatie mee over het intracellulaire.’

 

Complexe matrix

De vorige keer viel het de Wageningse onderzoeker op dat de Maastrichtse onderzoekers geen aanzet hadden gegeven om een complexe matrix te meten. Daarom implementeerde Van Grinsven deze keer een test waarmee je S. aureus in aanwezigheid van een overmaat van acht andere non-target-bacteriën kunt traceren (ratio 1:99 bij een totale concentratie van 1x10⁷ kolonievormende eenheden (kve) ml^-1).

‘Hierover merken de onderzoekers op dat maar een kleine hoeveelheid S. aureus kan binden door de aanwezigheid van een overmaat aan non-target-bacteriën’, gaat Van Amerongen verder. Hierdoor valt de faseverschuiving kleiner uit en dus de sensitiviteit lager. Vandaar dat de onderzoekers de betreffende chip vijf keer blootstelden aan hetzelfde monster, en tussendoor spoelden met buffer om niet-gebonden bacteriën te verwijderen van het oppervlak. ‘Daarbij groeit het signaal gradueel, maar wanneer weet je of je genoeg cycli hebt gedraaid?’, vraagt Van Amerongen zich af. ‘En wat doet deze aanpak met de snelheid van de test?’

Van Grinsven reageert: ‘Dit experiment voerden we uit om aan te geven dat je naar lagere concentraties kunt gaan als je werkt met een flush-set-up.’ Een enkele meting kan al in pakweg 20 minuten. ‘Maar door meermaals te flushen, kun je de gevoeligheid verhogen. Het is dus een afweging tussen snelheid en gevoeligheid.’ Met online meten kun je monitoren of je de het compromis hebt bereikt.

‘Van de editor van ACS Infectious Diseases kregen we het aanvullende verzoek om een daadwerkelijke applicatie van het platform te laten zien’, vertelt Van Grinsven. ‘Daarvoor kozen we een urinemonster in plaats van gesteriliseerd PBS ‘gespiked’ met E. coli.’ Bij deze omstandigheden duikt de sensitiviteit met een factor drie, maar blijft de methode volgens Van Grinsven overeind. ‘De basale eis ligt bij 5x104 kve ml^-1 en wij komen uit bij een detectielimiet van 3x104 kve ml^-1.’

 

‘De nieuwe techniek was eigenlijk een shot in the dark’

Van Amerongen reageert: ‘Dat de sensitiviteit zodanig terugloopt, vertelt mij dat er allerlei factoren effect hebben op de uitlezing. Wat als je te maken krijgt met urine van bijvoorbeeld diabetici, die heel veel suikers bevat? Die suikers zullen de competitie aangaan met je target. Hoe valt dat uit?’ De Maastrichtse onderzoeker zegt zich in Van Amerongens analyse te kunnen vinden. ‘Enerzijds zie ik de urinetest als een grote stap vooruit in onze methode-ontwikkeling. Anderzijds moeten we dit nog verder onderzoeken.’

 

Shot in the dark

Van Grinsven geeft aan dat TWTA eigenlijk een ‘shot in the dark’ was en zich nu bewijst als een interessante technologie met oog op de identificatie van bacteriën. ‘Er zit nog zeker rek in de techniek en evengoed aan de kant van de receptorlaag.’ De Maastrichtse onderzoeker laat weten dat hij nu op zoek is naar investeerders. Uit de lopende gesprekken blijkt dat er interesse is, zeker om deze techniek allereerst in het voedingsdomein in te gaan zetten – die sector is minder gereguleerd. ‘Ik zie geen reden om onze techniek eerst helemaal uit te ontwikkelen voor de medische sector, waar het een medische universiteit als de UM natuurlijk wel om te doen is. Een vroege vertaalslag naar de praktijk kan ons ook juist helpen om zo snel mogelijk een goed werkende medische versie te ontwikkelen.’

 

Chip

 

De Maastrichtse methode kan bacteriën onderscheiden door een afdruk te maken van de betreffende bacterie in een polyurethaanlaag, aangebracht op een aluminiumchip. Die aanpak creëert holtes met de kenmerkende oppervlaktestructuur van bijvoorbeeld E. coli, waardoor er een zogenoemd surface imprinted polymer (SIP) ontstaat.

 

Met thermal wave transport analysis (TWTA) stuur je vervolgens een thermische golf (veroorzaakt door een verhitter onder het chipoppervlak) door de chip heen en detecteert daarbij de faseverschuiving die deze ondergaat. Die verschuiving wordt veroorzaakt doordat de thermische massa toeneemt als gevolg van de binding van bacteriën aan het oppervlak van de chip.

 

Van Grinsven: ‘Eigenlijk hebben we hiermee vooral de ruis op het signaal die ons eerder bij de heat-transfer method (HTM) parten speelde, gereduceerd.’