Antivrieseiwitten zijn van levensbelang voor organismen die in ijzige omstandigheden leven. Deze eiwitten verlagen de vriestemperatuur door zich aan beginnende ijskristallen te binden en zo de uitgroei tot grotere, schadelijke kristallen en daarmee bevriezing te voorkomen. Deze thermal hysteresis (TH) activiteit was al theoretisch beschreven en is ook breed geaccepteerd, zegt Roderick Tas, postdoc in de Self-Organizing Soft Matter-groep aan de TU Eindhoven. ‘Maar wij laten nu voor het eerst op single-molecule niveau zien dat het ook echt zo is. Er is sprake van pinning, de individuele eiwitten bewegen helemaal niet meer. Tot nu konden we alleen de bulk meten en dan krijg je een gemiddelde. Daaruit wisten we wel dat de eiwitten sterk binden aan het ijsoppervlak, maar nu is duidelijk dat ze op individueel niveau permanent vastzitten en zich ook niet meer over het oppervlak verplaatsen.’   

Switch

De vastgepinde eiwitten blokkeren het ijsoppervlak, waardoor er steeds minder ruimte is voor het kristal om verder te groeien. ‘Groei wordt energetisch ongunstig en dat zorgt voor een verlaging van de vriestemperatuur’, zegt Tas. Dit verklaart het mechanisme dat leidt tot TH-activiteit, maar de meting van Tas en zijn collega’s Marco Hendrix en groepsleider Ilja Voets, brachten nog een nieuw antivriesmechanisme aan het licht. ‘We vonden dat ook eiwitten die iets zwakker binden aan het ijsoppervlak en niet permanent vastzitten, herkristallisatie activiteit kunnen remmen.’ 

Een enkele puntmutatie, van threonine 18 naar een asparagine op die plek, bleek al voldoende om AFP (antifreeze protein) type III te laten switchen van ‘pinning’ naar zwakkere binding. De vondst dat ook zwakkere bindende eiwitten bijdragen aan het antivrieseffect via ice recrystallization inhibition (IRI) was een mooie bijvangst van de metingen. In de natuur bepalen de omstandigheden waarin het organisme leeft welk mechanisme de voorrang krijgt. Tas: ‘Als de temperatuur altijd laag is en er hoe dan ook bevriezing optreedt, is het vooral handig dat je de herkristallisatie kunt verlagen en kunt zorgen dat de kristallen klein blijven. Als bevriezing geen gegeven is, maar wel kan voorkomen, dan is verlaging van het vriespunt ook gunstig om ijsvorming in eerste instantie te voorkomen.’  

Gecontroleerd afkoelen

De experimentele set-up bestaat uit een commerciële super-resolutiemicroscoop en een nieuw ontwikkelde sample houder, vertelt Tas. ‘Die kan heel gecontroleerd het sample met een tiende graad afkoelen tot tien graden onder nul. Dat is het nieuwe aspect van onze aanpak.’ Hij voorziet nog veel meer mogelijkheden voor deze nieuwe techniek. ‘Heel veel interacties in biologische omgevingen zijn temperatuursafhankelijk, zoals DNA-DNA interacties. Het is heel interessant dat we nu op single-molecule niveau ook bij heel lage temperaturen kunnen kijken wat de effecten zijn op biologische systemen.’

Tas noemt vriesschade aan cellen als voorbeeld. ‘Wat gebeurt er precies als een cel bevriest en weer ontdooit? Welke schade levert dat op?’ Die inzichten zouden wellicht kunnen helpen om in de toekomst vriesschade aan donororganen te voorkomen en ze dus langer te kunnen bewaren. Dan hebben we het wel over de verre toekomst, benadrukt Tas. ‘Een nadeel van deze techniek is dat je met heel kleine volumes werkt. Om een compleet orgaan in detail te bekijken, dat is nog een heel grote stap.’  

Roderick Tas, Marco Hendrix, Ilja Voets, Nanoscopy of single antifreeze proteins reveals that reversible ice binding is sufficient for ice recrystallization inhibition but not thermal hysteresis, PNAS (2023)